■任雨龍 王秋菊 孫 愉 張 昊 魏 笑 高炳南 李暢洋

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍 江大慶 163319）

近些年，為了減少抗生素在養(yǎng)殖行業(yè)中的大量濫用，人們開始研制各種微生物制劑來代替抗生素的使用[1]。微生物制劑在很多領(lǐng)域內(nèi)都發(fā)揮著重要的作用，尤其是食品、飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，有著較為廣闊的發(fā)展前景[2-3]。瘤胃微生物與微生物制劑的研究也成為了人們較為感興趣的內(nèi)容，希望通過在飼料中添加某些微生物，直接或間接地改善反芻動物的生產(chǎn)性能，降低疾病發(fā)生概率，調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝的正常進行[4-5]。但目前用于反芻動物微生物制劑的菌種較為單一，而瘤胃又是反芻動物體內(nèi)最復(fù)雜的消化系統(tǒng)之一，存在著大量的微生物。比如原蟲、細菌、真菌等，也是營養(yǎng)物質(zhì)消化分解的主要部位[6]。因此，如何從反芻動物瘤胃中發(fā)現(xiàn)更多能夠用于研制微生物制劑的菌類，開發(fā)出效果更好的單菌或者復(fù)合微生物制劑，從而促進瘤胃生理功能的充分發(fā)揮，提高動物的營養(yǎng)利用效率，改善動物的生產(chǎn)性能，達到提高奶牛養(yǎng)殖行業(yè)生產(chǎn)收入的目的，是目前研究的主要內(nèi)容。

本研究旨在通過16S rDNA序列同源性比較以及系統(tǒng)進化樹分析等方法對分離的菌株進行種屬鑒定，從荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)分離出可以用于微生物制劑研制的菌類和引起常見疾病的病原菌，并確定其生化特性，從而為微生物制劑的研發(fā)提供備選菌種信息以及為有害病原菌的防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從黑龍江省九三某奶牛養(yǎng)殖場選取10頭荷斯坦奶牛，于早晨6：30～7：30利用負壓裝置采集瘤胃內(nèi)容物，瘤胃內(nèi)容物裝瓶后，用封口膜纏繞瓶口，置于保溫泡沫箱中迅速帶回實驗室，采樣奶牛具體信息如表1所示。

表1 采樣奶牛信息

本試驗采樣的養(yǎng)殖場根據(jù)產(chǎn)奶量以及泌乳天數(shù)進行分群飼養(yǎng)，采用全混合日糧（TMR）飼喂技術(shù)，青貯飼料、干草和精料等均衡供應(yīng)，自由飲水。每天分別在06：00、14：00 和21：00 進行擠奶，發(fā)料車于每次擠奶30 min 后進行撒料。飼糧組成以及營養(yǎng)水平如表2所示。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.1.2 引物合成與測序

在本試驗中，提取完DNA進行PCR擴增時，添加細菌通用引物，由上海生物工程股份有限公司完成通用引物的合成以及測序內(nèi)容。所用的引物序列為：

F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[7]。

1.1.3 培養(yǎng)基以及試劑（見表3）

表3 試驗所用試劑

1.1.4 主要儀器（見表4）

表4 試驗儀器設(shè)備

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

將各培養(yǎng)基按照說明書配比稱取好后置于250 mL無菌錐形瓶中，放于水浴鍋中加熱，玻璃棒攪拌溶解5～10 min。然后用牛皮紙將錐形瓶包好，再置于高壓滅菌鍋中，121 ℃，15 min，進行滅菌操作。滅菌完成后，待培養(yǎng)基溫度冷卻到手可以拿起時（50 ℃左右），進行倒板，培養(yǎng)基厚度大約為玻璃平皿高度的1/3。倒板結(jié)束后，待所有培養(yǎng)基冷卻凝固，纏上封口膜，置于超凈臺中進行紫外線滅菌。

1.2.2 樣品處理

事先將滅過菌的1 000 mL藍蓋瓶充滿CO2置于水浴鍋中37 ℃保溫，準備一個泡沫箱，在泡沫箱中放一些保溫袋，然后將藍蓋瓶放于泡沫箱中，等待采取瘤胃內(nèi)容物。瘤胃內(nèi)容物采集完成之后，使用無菌醫(yī)用紗布過濾掉飼料殘渣，濾液置于新的藍蓋瓶中，進行離心。

1.2.3 細菌培養(yǎng)

在超凈臺中，用生理鹽水將離心好的瘤胃上清液稀釋至不同的濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9），然后取10-6、10-7、10-8、10-9四個濃度進行涂布，每個濃度分別做兩組，一組置于厭氧培養(yǎng)箱，另外一組置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3個重復(fù)。接菌時每個培養(yǎng)平皿中接種100 μL 稀釋菌液，用涂布棒將菌液均勻涂布在平皿中，做好標記。

在涂布完成后，每隔12 h將平皿里生長的單個菌落進行挑菌操作，將挑出的菌落用劃線的方法接到新培養(yǎng)基平皿中，重復(fù)此步驟4～5次。若培養(yǎng)基平皿中的菌落完全相同，沒有雜菌生長，則說明純化培養(yǎng)完成，可進行后續(xù)試驗。

1.2.4 菌的保存

純化完成的菌一部分接種到液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用移液槍抽取配置好的30%甘油以1∶1的比例，混合于EP管中，混勻后再置于-80 ℃冰箱中凍存，即完成保菌工作。

1.2.5 菌的鑒定

DNA 的提取通過物理提取法或者試劑盒提取均可達到試驗要求，在本試驗中，利用試劑盒（TIAN GEN）完成菌DNA 提取，再繼續(xù)進行后續(xù)PCR擴增試驗，擴增反應(yīng)體系見表5。

表5 PCR反應(yīng)體系

在進行PCR反應(yīng)時，設(shè)置反應(yīng)程序為：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃延伸30 s，整個PCR反應(yīng)包括30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

在PCR 程序結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，由于本試驗中預(yù)計基因片段大小在1 500 bp左右，因此瓊脂糖濃度選擇1%即可滿足試驗需要。在凝膠樣空中加入6 μL 擴增產(chǎn)物，同時使用DL 2000 Marker作為電泳參照。

電泳完成后，將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送到委托公司測序。

1.2.6 生化特性鑒定

本試驗所有細菌生化特性的鑒定方法主要參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》和《微生物學(xué)及檢驗技術(shù)試驗指導(dǎo)》進行。

①纖維素酶活性的鑒定[8]

培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O、NaCl 0.5 g、（NH4）2SO41 g、瓊脂15 g、純化水1 000 mL。調(diào)pH至7.21，121 ℃滅菌20 min。

試劑：FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl20.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、100 mL純化水。

評定方法：將接過菌的平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h 后，用移液槍吸取2 mL 的剛果紅溶液（1 mg/mL）添加到培養(yǎng)基中，靜置15 min 后倒去液體，添加2 mL的NaCl溶液（1 mol/mL），靜置15 min后倒去液體，觀察是否有透明圈產(chǎn)生，透明圈的大小跟菌降解纖維素的能力有關(guān)。

②產(chǎn)蛋白酶活性的鑒定[9]

培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O 1.07 g、K2HPO40.36 g、酪蛋白4 g、ZnCl20.014 g、NaCl 1.2 g、CaCl20.002 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.02 g、瓊脂20 g、純化水1 000 mL。

試劑：氯化汞15 g，濃鹽酸20 mL，純化水100 mL。

評定方法：將菌接種到培養(yǎng)基之后，37 ℃培養(yǎng)24-48 h，滴加顯色試劑，觀察菌落周圍是否有透明區(qū)域產(chǎn)生。

③產(chǎn)淀粉酶活性的鑒定[9]

培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、純化水1 000 mL。

試劑：碘液。

評定方法：將菌接種于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后在菌落處滴加碘液，碘液范圍要覆蓋菌落，觀察菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)，透明圈的大小與菌產(chǎn)生淀粉酶的能力有關(guān)。

④硝酸鹽還原試驗[10]

培養(yǎng)基：琥珀酸鈉10 g、NaNO31 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.2 g、蒸餾水1 000 mL，配制完成后通CO22～3 min。

試劑：Griess試劑。

評定方法：將各個菌接入到培養(yǎng)基中，接完菌后37 ℃培養(yǎng)24 h。用移液槍或無菌注射器抽取菌液，取適量置于平皿中，平皿置于白紙上（使顯色更加明顯）。抽取配好的Griess 試劑，每個平皿中1 滴即可，30 s 后發(fā)生變色（即產(chǎn)生紅色或者粉色，說明該菌具有還原性，若不變色，則不具有還原性）

⑤甲基紅（Methyl red）試驗[10]

培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、KH2PO40.5 g、1 000 mL 純化水、加熱溶解，調(diào)pH 至7.2，6.895×10-2MPa，滅菌15 min，分裝各個試管，具體配制視試驗所需，按比例縮小。

試劑：甲基紅0.02 g、95%乙醇溶液60 mL、純化水40 mL，將甲基紅碾碎放于乙醇溶液中，再添加純化水。

評定方法：將菌接入試管中，35 ℃，48 h，取出部分培養(yǎng)液滴加甲基紅指示劑，觀察顏色變化。若為紅色（即不變色），則呈陽性，若為黃色（即變色），則呈陰性。

⑥產(chǎn)硫化氫試驗

培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。

評定方法：本培養(yǎng)基可倒平板也可倒斜面（本研究發(fā)現(xiàn)倒斜面效果會更加明顯），將菌穿刺接入培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?，呈陽性，無變化呈陰性。

⑦靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）[11]

培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、1 000 mL 純化水，調(diào)pH 至7.6，6.895×10-2MPa 滅菌15 min，分裝各個試管。

試劑：對二甲基氨基苯甲醛5 g、95%乙醇溶液150 mL、濃鹽酸50 mL。

評定方法：將菌分別接種到各個試管中，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，取出部分培養(yǎng)液滴加顯色試劑，觀察顏色變化。若為紅色（即變色），則呈陽性，若為黃色（即不變色），則呈陰性。

⑧尿素酶試驗[11]

培養(yǎng)基：將葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、KH2PO42 g、NaCl 5 g 混合于1 000 mL 純化水中，加熱溶解，調(diào)pH 至7.2，再加瓊脂20 g、0.4 %酚紅溶液2 mL，混勻過濾。高壓滅菌20 min，待溫度冷至60 ℃左右時，加入用濾菌器過濾的50 %尿素水1 mL，混勻后倒平板或者斜面。

評定方法：將菌接種入平板后，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基呈紅色為陽性，不變色為陰性。

⑨接觸酶試驗[12]

試劑：3%H2O2溶液。

評定方法：將菌液滴數(shù)滴置于高壓滅菌的試管或者玻片上，再滴加3%的H2O2。若產(chǎn)生大量氣泡則為陽性，沒有氣泡產(chǎn)生則為陰性。直接將3%H2O2溶液滴加到不含血液成分的菌培養(yǎng)液中，也能觀察到上述現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖1）

圖1 部分細菌PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

提取細菌DNA，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)目的基因片段大小為1 500 bp左右，與預(yù)測基因片段大小相符。結(jié)果如圖1所示。

2.2 基因測序（見表6、圖2）

表6 16S rRNA系列比對結(jié)果

將PCR 擴增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司完成測序工作，再把測序結(jié)果在NCBI 的GenBank中進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)獲得菌種的同源性在99%以上，比對結(jié)果如表6所示。

本研究從奶牛瘤胃內(nèi)容物中共分離得到32株細菌，12 種菌。主要包括：枯草芽孢桿菌CC2FG2、地衣芽孢桿菌LR2HG4、芽孢球菌PA3、馬鏈球菌LU1542、不動桿菌Ue2-1、弗氏檸檬酸桿菌K32、假單胞菌705B5、溶血性葡萄球菌PH4-1、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌LP1547、吉氏庫特菌LA3、腸球菌DSM7374、雙歧桿菌N145。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）

圖2 部分細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

利用Mega7.0 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步證明了試驗所篩選出來的菌與GenBank 比對結(jié)果的準確性，同源性均達到97%以上。

2.4 生化特性鑒定結(jié)果（見表7）

本研究主要對分離得到的菌進行了革蘭氏陰陽性、硝酸還原、靛基質(zhì)（吲哚）、產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接觸酶以及發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)硫化氫等特性進行了鑒定。生化特性鑒定的結(jié)果如下表7所示。

表7 不同菌種的生化特性鑒定

3 討論

本研究中所用的培養(yǎng)基從功能上來劃分，主要分為兩種：富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基。但是有些分離培養(yǎng)基中得到的菌和目標菌并不相同，一部分原因可能是培養(yǎng)基的特異性不強，還有一部分原因可能是由于菌培養(yǎng)的環(huán)境不統(tǒng)一，比如濕度、氧氣含量等，都可能會影響菌的生長以及傳代過程[13]。此外，接菌、挑菌等操作的正確性也對試驗有很大的影響，任何錯誤或者不當?shù)牟僮鞫伎赡軙斐删奈廴净蛘吣繕思毦乃劳鯷14]。

鄧慧媛[15]從奶牛瘤胃中分離出了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，本試驗和其相比的話，培養(yǎng)出了弗氏檸檬酸桿菌、吉氏庫特菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、雙歧桿菌等菌種。這種情況主要是由于培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)環(huán)境的不同造成的。而近年來關(guān)于牛源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌以及吉氏庫特菌的研究較少，對其一些生物學(xué)特性并不清楚。本試驗填充了這部分信息的空白。

此外，瘤胃微生物的分離可以根據(jù)試驗所需制備不同成分的培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)環(huán)境，從而篩選出想要獲得的目標菌種。傅帥[16]通過減少培養(yǎng)基中蛋氨酸的含量，改進發(fā)酵條件，從瘤胃內(nèi)容物中篩選出一株能夠合成蛋氨酸的熱帶假絲酵母菌。王平[17]利用纖維素剛果紅培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，從牛瘤胃內(nèi)容物中分離出具有較強纖維素分解能力的纖維素酶高產(chǎn)菌株。在這些分離菌的試驗中，影響分離菌株種類的一個重要因素是培養(yǎng)環(huán)境氧氣含量。因為瘤胃中大多數(shù)的微生物都嚴格厭氧，如果在常規(guī)的恒溫箱中培養(yǎng)，最后得到的是好氧菌或者兼性厭氧一類的菌種，而厭氧菌在這種環(huán)境中生長較為困難，這也是本試驗中設(shè)計厭氧、好氧兩種培養(yǎng)環(huán)境的原因。

有關(guān)分離動物微生物的研究較多，但研究對象大部分都集中在單胃動物上[18]，在反芻動物上主要關(guān)注于微生物多樣性的分析，這可能與反芻動物獨特的消化方式有關(guān)[19]。有研究認為由于瘤胃中存在大量微生物的原因，飼料中添加的單一菌種微生物制劑在較短時間會被反芻動物通過代謝作用排出體外[20]。在犢牛飼料中添加微生物制劑，會改變犢牛瘤胃微生物區(qū)系，影響優(yōu)勢菌的定植[21]。而在成年奶牛添加微生物制劑，在短時期內(nèi)也會起到改善瘤胃內(nèi)環(huán)境、增加奶牛的產(chǎn)奶量和增強免疫力等作用[22-25]。目前運用于反芻動物的微生物制劑較少，菌種較為單一，多種復(fù)合菌制劑的開發(fā)將是接下來研究的熱點。因此，從瘤胃中分離更多微生物，可以為微生物制劑提供更多的菌種參考，幫助開發(fā)更多種類的反芻動物微生物制劑。

4 結(jié)論

①本試驗從荷斯坦奶牛瘤胃中共分離出32 株菌，其中益生菌有12 株，致病菌有20 株，益生菌占比相對較少。

②推測本次采樣奶牛場中環(huán)境或者飼料存在一定的問題，對奶牛的生產(chǎn)性能存在一定的影響。

③在本試驗中，益生菌的鑒定以及生化特性的檢測作為后備菌種為微生物制劑的研究開發(fā)提供幫助。