■劉正群 李澤青 李 寧 于海霞 鄭 梓 穆淑琴 王鴻英 閆 峻*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300061）

生豬養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用，極易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加及環(huán)境污染等問題。因此，尋找安全、高效的飼料添加劑替代抗生素是當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)和研究中的熱點(diǎn)問題[1]。有機(jī)酸作為一類天然、安全的飼料添加劑，在仔豬飼糧中添加可有效降低消化道pH，并提高消化酶的活性和養(yǎng)分消化率，從而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[2]。同時(shí)，飼糧中有機(jī)酸的添加還可調(diào)控動(dòng)物腸道微生物菌群組成，提高機(jī)體的抗氧化和免疫機(jī)能，起到保護(hù)胃腸道黏膜健康等作用[3-4]。有機(jī)酸是一類含有羧基的有機(jī)化合物，主要包括飽和脂肪酸和含有羥基或不飽和化學(xué)鍵的脂肪酸等，不同類型的有機(jī)酸的功能差異較大，但單一類型的有機(jī)酸的作用效果有限[5]。因此，為達(dá)到抑制有害菌、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗氧化和免疫機(jī)能等效果，在動(dòng)物飼糧中通常添加多種有機(jī)酸的復(fù)合物，而由于不同研究中有機(jī)酸的種類和組合并不一致，導(dǎo)致不同試驗(yàn)中復(fù)合有機(jī)酸的作用效果之間也存在較大差異[5-6]。前期關(guān)于有機(jī)酸的研究多集中在斷奶仔豬階段，而復(fù)合有機(jī)酸對(duì)20～50 kg的生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率及糞便微生物區(qū)系等的影響作用研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少[2-6]。因此，本試驗(yàn)旨在研究特定比例的有機(jī)酸組合（甲酸、乳酸、檸檬酸和月桂酸）對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率、抗氧化功能和糞便微生物區(qū)系的影響，為復(fù)合有機(jī)酸在生長(zhǎng)豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的復(fù)合有機(jī)酸制劑為甲酸、乳酸、檸檬酸和月桂酸的復(fù)合物，其中各種有機(jī)酸的比例分別為甲酸≥23.9%、乳酸≥14.5%、檸檬酸≥4.0%、月桂酸≥8.6%，其余為載體（二氧化硅）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用初始體重相近（25.1±1.2）kg的“杜洛克×長(zhǎng)白×大白”雜交閹公豬72頭，隨機(jī)分為2組，分別為對(duì)照組（CON組）和復(fù)合有機(jī)酸添加組（COA組），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，復(fù)合有機(jī)酸添加組則在基礎(chǔ)飼糧中添加0.3%的復(fù)合有機(jī)酸。

基礎(chǔ)飼糧中各營養(yǎng)成分含量滿足或超過NRC（2012）[7]中生長(zhǎng)豬的營養(yǎng)需要量，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期5 d，正式試驗(yàn)期28 d，期間豬只自由飲水和采食，并按照豬場(chǎng)正常的飼喂、免疫流程進(jìn)行飼喂管理。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 生長(zhǎng)性能

正式試驗(yàn)第1 d 和試驗(yàn)結(jié)束后最后1 d 的早晨，對(duì)試驗(yàn)豬空腹稱重，分別記為初重和末重，根據(jù)試驗(yàn)天數(shù)計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 養(yǎng)分表觀消化率

試驗(yàn)第12～14 d，以欄為單位收集糞便，在每天14：00-15：00 為收糞時(shí)間，連收3 d，用酸不溶灰分（AIA）作為內(nèi)源指示劑測(cè)定粗蛋白（CP）、粗纖維（CF）、粗脂肪（EE）、鈣（Ca）和磷（P）的表觀全消化道消化率（ATTD）。

ATTD（%）=100-（AIAd×Nf）/（AIAf×Nd）×100

式中：AIAd——飼糧中酸不溶灰分的含量（%）；

Nf——糞樣中養(yǎng)分的含量（%）；

AIAf——糞樣中酸不溶灰分含量（%）；

Nd——飼糧中養(yǎng)分的含量（%）。

1.3.3 血清抗氧化指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇1 頭豬，空腹12 h后前腔靜脈采血,低溫條件下3 000 r/min離心15 min制備血清，于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。血清總超氧化物歧化酶（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量測(cè)定使用ELISA方法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4 糞便微生物多樣性測(cè)定

在試驗(yàn)第27 d上午飼喂后，按照微生物試驗(yàn)采樣要求，收集新鮮的仔豬糞便，每組每個(gè)重復(fù)收取6頭豬的新鮮糞便。觀察到豬只開始出現(xiàn)排便反應(yīng)，及時(shí)戴好無菌手套接住糞便，盡量采集糞便中段3～5 cm的樣品，約5 g轉(zhuǎn)移至無菌凍存管中，立即放入液氮，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，用以進(jìn)行糞便菌群分析。

使用DNA試劑盒（Omega, Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取豬糞便樣品的微生物總DNA，提取后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）檢測(cè)所提取的微生物DNA的總量和質(zhì)量。對(duì)總量和質(zhì)量達(dá)標(biāo)的細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4高可變區(qū)設(shè)計(jì)含有barcode的特異引物，使用ABI GeneAmp?9700 型（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）PCR儀器，采用Trans Gen AP221-02體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，特異性引物序列為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。Illumina MiSeq（Illumina Inc., San Diego, CA，USA）測(cè)序和數(shù)據(jù)分析由百邁客生物科技有限公司測(cè)定（北京，中國）完成。微生物的DNA樣品檢測(cè)、PCR、純化、建庫、MiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)分析均按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。使用Mothur（version v.1.30.1）及Usearch（vsesion 7.0）等軟件，將測(cè)序序列在97%的相似水平下進(jìn)行OUT（Operational Taxonomic Units）聚類及生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SAS 9.4軟件GLM模塊進(jìn)行T檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響（見表2）

表2 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，復(fù)合有機(jī)酸組生長(zhǎng)豬的終末體重和總增重分別比對(duì)照組的生長(zhǎng)豬增加2.71 kg和2.69 kg（P＜0.05），平均日采食量和平均日增重分別增加124.00 g 和96.19 g（P＜0.05），而料重比降低了0.13（P＜0.05）。

2.2 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬養(yǎng)分表觀全消化道消化率的影響（見表3）

表3 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬養(yǎng)分表觀全消化道消化率的影響(%)

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸的生長(zhǎng)豬對(duì)飼糧中粗蛋白的表觀全消化道消化率無顯著影響，但粗脂肪、鈣和磷的表觀消化率分別顯著提高了40.30%、28.24%和20.11%（P＜0.05），且復(fù)合有機(jī)酸的添加有提高粗纖維表觀消化率的趨勢(shì)（P=0.071）。

2.3 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬血清抗氧化能力的影響（見表4）

表4 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬血清抗氧化能力的影響

由表4 可知，與對(duì)照組相比，飼喂復(fù)合有機(jī)酸的生長(zhǎng)豬的血清中總超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性分別提高6.50 U/mL 和62.43 U/mL（P＜0.05），總抗氧化能力提高0.67 U/mL（P＜0.05），而丙二醛含量降低0.44 nmol/mL（P＜0.05）。

2.4 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬糞樣微生物組成及功能的影響（見圖1～圖5）

由圖1 可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬糞便微生物的多樣性（Shannon指數(shù)，圖1A）無顯著差異，但Ace 指數(shù)（圖1B）和Chao 指數(shù)（圖1C）顯著增加（P＜0.05），表明復(fù)合有機(jī)酸的添加提高了生長(zhǎng)豬糞便微生物的相對(duì)豐度。

圖1 糞便微生物α多樣性

微生物的β-多樣性采用主坐標(biāo)分析（PCoA）和加權(quán)（weighted）的非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS），糞便樣本微生物之間的距離在一定程度上代表了糞便微生物之間的差異度，距離越近越相似，距離越遠(yuǎn)差異越大?；赑CoA分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合有機(jī)酸組微生物與對(duì)照組微生物距離較遠(yuǎn)（圖2A），而基于加權(quán)的NMDS分析屬水平微生物的結(jié)果STRESS值均小于0.20，分析較可靠（圖2B）。與對(duì)照組相比，復(fù)合有機(jī)酸組中微生物樣品之間聚類明顯，腸道微生物相似性較高的距離較近，說明在生長(zhǎng)豬基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸可以有效改變其腸道微生物區(qū)系。

圖2 糞便微生物β多樣性

由圖3可知，添加復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬糞便微生物在門水平上的組成影響較小（圖3A），僅Kiritimatiellaeota 門微生物相對(duì)豐度提高了約1.2%（圖3B）；而有機(jī)酸的添加對(duì)生長(zhǎng)豬糞便微生物組成在屬的水平上發(fā)生了明顯改變（圖3C），有機(jī)酸的添加顯著提高了鏈球菌屬（Streptococcus）的相對(duì)豐度，但顯著降低了Prevotellaceae NK3B31 group和parabacteroides屬 微 生物的相對(duì)豐度（圖3D，P＜0.05）。

圖3 生長(zhǎng)豬糞便中門和屬水平的微生物組成及差異

根據(jù)LEfSe進(jìn)化樹（LEfSe Cladogram）及LDA（Linear Discriminant Analysis）得分圖顯示（圖4），復(fù)合有機(jī)酸的添加導(dǎo)致其糞便的核心微生物發(fā)生了變化。其中復(fù)合有機(jī)酸添加組中核心微生物為芽孢桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactobacillales），鏈球菌科（Streptococcaceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae），鏈球菌屬（Streptococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），及非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus），乳桿菌（Lactobacillussp.）和羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri），其中芽孢桿菌綱LDA值最高為4.81。而對(duì)照組組的核心微生物為理研菌科（Rikenellaceae），Rikenellaceae RC9 gut group、Lachnospiraceae AC2044 group 和Prevotellaceae NK3B31 group 屬，及uncultured bacterium g Rikenellaceae RC9 gut group、uncultured bacterium g Prevotellaceae NK3B31 group和uncultured bacterium g Lachnospiraceae AC2044 group等3種未培養(yǎng)的微生物，其中理研菌科LDA值最高為4.27。

圖4 組間群落差異分析及LDA得分

使用PICRUSt2基于已經(jīng)建立的胃腸道菌群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對(duì)兩組糞便微生物區(qū)系進(jìn)行KEGG功能預(yù)測(cè)，結(jié)果表明共注釋到265個(gè)第三級(jí)分類水平的代謝通路，分別屬于43個(gè)二級(jí)分類的KEGG代謝途徑，其中豐度超過1%的微生物注釋到的功能分別為：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基糖和核苷酸糖代謝、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成、抗生素的生物合成、次生代謝物的生物合成、碳代謝、糖酵解/糖異生、代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、丙酮酸代謝、群體感應(yīng)、核糖體、兩組分系統(tǒng)及其他功能，且采食兩種飼糧對(duì)兩組糞便微生物主要代謝功能之間均無顯著差異（圖5）。

圖5 生長(zhǎng)豬糞便微生物KEGG功能預(yù)測(cè)

3 討論

3.1 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能及養(yǎng)分表觀消化率的影響

幼齡動(dòng)物（如斷奶仔豬）由于其消化系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，胃中鹽酸分泌不足，使得胃腸道pH升高，從而導(dǎo)致無法有效地消化飼糧中的蛋白質(zhì)、淀粉等養(yǎng)分[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中有機(jī)酸制劑的添加可通過降低動(dòng)物胃腸道pH，提高消化酶的活性，維持機(jī)體胃腸道最佳的消化環(huán)境，改善斷奶仔豬的腸道健康，從而提高仔豬的生長(zhǎng)性能，如提高仔豬的采食量、平均日增重及終體重，并降低料重比（F/G）和仔豬腹瀉的發(fā)生[6，10-11]。但復(fù)合有機(jī)酸的添加對(duì)生長(zhǎng)育肥豬生長(zhǎng)性能影響的研究報(bào)道較少。Partanen等[12]研究表明，飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸（甲酸和乳酸）可提高育肥豬育肥期總增重及平均日增重，同時(shí)可提高飼料的轉(zhuǎn)化率。同樣地，栗敏等[13]和李馬成等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)育肥豬飼糧中添加不同劑量的代謝有機(jī)酸（丙酮酸、α-酮戊二酸和檸檬酸的混合物），均可一定程度提高生長(zhǎng)育肥豬的生長(zhǎng)性能。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果類似，在生長(zhǎng)豬飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸可有效提高生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能（如提高平均日采食量、生長(zhǎng)期總增重及平均日增重），同時(shí)可有效降低料重比?？赡艿臋C(jī)制是：部分有機(jī)酸具有芳香味，可以改善日糧的適口性，促進(jìn)動(dòng)物采食并增加采食量，同時(shí)降低消化道的pH、提高消化酶的活性進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)發(fā)育[2，4]；此外，部分有機(jī)酸可作為腸上皮細(xì)胞的一種代謝燃料，維護(hù)腸黏膜形態(tài)和功能的完整性，改善腸道消化吸收功能[15]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加有機(jī)酸可提高蛋白質(zhì)等的表觀消化率，同時(shí)還可減少有害氣體的排放[16-18]。同樣地，復(fù)合有機(jī)酸的添加可提高生長(zhǎng)豬表觀回腸氨基酸消化率及主要養(yǎng)分的表觀全消化道消化率[19]。Boling 等[20]研究表明，檸檬酸的添加可提高生長(zhǎng)豬對(duì)飼糧中植酸磷的利用。而在本研究中，豬飼糧添加復(fù)合有機(jī)酸后，顯著提高了仔豬對(duì)粗脂肪、鈣和磷等營養(yǎng)成分的表觀全消化道消化率。其可能原因在于，飼糧中復(fù)合有機(jī)酸的添加可以降低動(dòng)物胃腸道的pH，較低的pH 促進(jìn)磷的溶解度，且可減緩胃排空速度，增加食糜在胃內(nèi)的消化時(shí)間，更利于養(yǎng)分的消化和吸收[2，15，21]。因此，有機(jī)酸通常被作為一種可提高畜禽養(yǎng)分消化率的飼料添加劑。

3.2 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬抗氧化功能的影響

機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持主要是依賴于機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，自由基等產(chǎn)生過量或者機(jī)體抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，則會(huì)打破這種動(dòng)態(tài)平衡，引起氧化應(yīng)激[22]。本研究與前期研究結(jié)果一致，生長(zhǎng)豬飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸，可顯著提高血清中總超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶等的活性，提高了機(jī)體的總抗氧化能力，同時(shí)機(jī)體脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物丙二醛含量也有所降低，表明有機(jī)酸可有效改善動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力[23]。原因可能為部分有機(jī)酸可直接參與三羧酸循環(huán)供能，其額外產(chǎn)生的能量提高了機(jī)體對(duì)自由基清除能力，從而提高機(jī)體抗氧化能力；部分有機(jī)酸可通過谷胱甘肽過氧化物酶或其他非酶促反應(yīng)，減少自由基的產(chǎn)生[5]，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.3 復(fù)合有機(jī)酸對(duì)生長(zhǎng)豬糞便微生物組成及功能的影響

腸道微生物對(duì)機(jī)體的代謝和機(jī)體發(fā)育至關(guān)重要，保持動(dòng)態(tài)平衡的腸道微生態(tài)環(huán)境不僅有助于仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，還能形成微生物屏障以阻止病原菌的入侵并促進(jìn)其腸道發(fā)揮各種功能[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加有機(jī)酸顯著提高了生長(zhǎng)豬糞便微生物的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)，同時(shí)復(fù)合有機(jī)酸添加組中微生物樣品之間聚類明顯，腸道微生物相似性較高，表明在生長(zhǎng)豬飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸可以有效改變物種組成的豐富度和均勻度，改善其腸道微生物區(qū)系[5]。與前期研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合有機(jī)酸后，可將生長(zhǎng)豬糞便中核心微生物物種轉(zhuǎn)換為非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus）、乳桿菌（Lactobacillussp.）和羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）等益生菌，同時(shí)可調(diào)節(jié)腸道免疫力與抗氧化能力，用于提高畜禽的腸道健康[25-27]。復(fù)合有機(jī)酸提高生長(zhǎng)豬糞便中非解乳糖鏈球菌和羅伊氏乳桿菌等益生菌豐度可能途徑為：有機(jī)酸的添加降低了消化道的pH，并使細(xì)菌所處的外部環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致其自身能量損耗，導(dǎo)致其生長(zhǎng)受阻[28]；而消化道pH的降低也有利于刺激乳酸菌等有益菌的代謝活動(dòng)，加速其生長(zhǎng)和繁殖[27]。但復(fù)合有機(jī)酸促進(jìn)益生菌增殖及促進(jìn)腸道健康的具體機(jī)制仍需深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，生長(zhǎng)豬飼糧中添加0.3%復(fù)合有機(jī)酸可提高生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能和抗氧化機(jī)能，同時(shí)可提高飼糧養(yǎng)分表觀消化率和腸道有益菌的豐度，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。