■馮定遠

（華南農業(yè)大學，廣東 廣州 510642）

有關外源性酶制劑對反芻動物作用的研究，始于20 世紀60 年代（Burroughs 等，1960；Rovics 等，1962；Rust等，1965），但酶制劑作用效果不穩(wěn)定。隨著發(fā)酵成本降低及更多高活性酶制劑問世，促進了外源性酶制劑在反芻動物中的應用有更多的研究（Chen 等，1995；Beauchemin 等，1997；McAllister 等，1999）。向奶牛日糧中使用的紫花苜蓿莖稈添加酶制劑，產奶量由23.7 kg/d，最高增加到25.6 kg/d，產奶量對酶制劑的反應在產奶前期更明顯（McAllister 等，2001）。使用木聚糖酶和纖維素酶混合物及單一纖維素酶，分別增加飼喂紫花苜蓿干草或梯牧草干草肉牛的平均日增重30%和36%（Beauchemin 等，1995）。在Beauchemin等（2010）的反芻動物用酶的綜述文章中總結出的結論是：只有當可消化能是第一限制營養(yǎng)時，添加纖維分解類酶制劑的效果最顯著。外源性酶制劑對反芻動物特別是奶牛和肉牛生產性能具有促進作用已經得到證實，但應用結果缺乏一致性。這很正常，單胃動物（豬禽）也是如此，何況更復雜的反芻動物，影響因素多，理論上瘤胃微生物已經具備了所有酶制劑的功能。目前反芻動物的飼料酶制劑應用，仍然采用單胃動物的模式，這是不完善的，基于反芻動物瘤胃的功能和飼料的復雜性，外源酶制劑作用模式有本質的差異，有必要建立反芻動物酶制劑應用的技術體系。

1 添加酶制劑的前提與反芻動物飼料酶的復雜性

飼料酶制劑的研究主要是單胃動物（豬禽）比較多（馮定遠，2017），這里討論的反芻動物酶制劑應用主要是成年動物，在瘤胃發(fā)育和微生態(tài)功能完善之前的幼年動物如犢牛，基本上可以用單胃動物如豬禽的思路使用酶制劑。近年來，我國也開始重視反芻動物酶制劑的研究與開發(fā)（賈仙寶，2009；呼和等，2011；徐學文等，2012；扈添琴，2013；李朝云，2014；解祥學等，2016；林靜等，2017；楊澤坤，2017）。在最近的報道中，陳雅坤等（2018）使用寧夏夏盛公司奶牛專用酶（纖維素酶15 000 U/g、木聚糖酶100 000 U/g、葡聚糖酶280 000 U/g、甘露聚糖酶2 500 U/g、果膠酶60 000 U/g、中性蛋白酶2 000 U/g）進行試驗，0.15%添加量，泌乳早期奶牛產奶量每天增加4.27 kg。趙連生等（2018）試驗同樣的采用夏盛奶牛專用酶，提高奶牛飼料轉化率、瘤胃發(fā)酵指標和產奶量。國外新近反芻用酶報道有Sidique等（2019）、Devant等（2020）、Lourenco 等（2020）、Rossow 等（2020）、Zayed 等（2020）、Abd-Elkerem 等（2021）、Azzaz 等（2021）、Pech-Cervantes 等（2021）。這些試驗結果不一致，有些使用外源酶制劑效果顯著，有些沒有什么作用。說明了酶制劑應用的復雜性，而反芻動物的瘤胃特性和飼料原料特點更加大了反芻飼料酶的復雜程度。

源于瘤胃微生物作用和微生態(tài)系統(tǒng)，成年健康反芻動物瘤胃微生物理論上可以解決所有的飼料消化與脫毒問題。已經鑒定出瘤胃的分解植物性多聚糖細胞壁的酶有21 種之多，這些酶均產自正常功能的瘤胃微生物（White等，1993）。正常情況下，特別是中等生產性能水平、無應激生理狀態(tài)下，不需要額外添加外源酶制劑。

反芻動物高產是高投入高產出的生產活動，高采食量或者富營養(yǎng)狀態(tài)，超過了瘤胃本身微生物產酶能力能夠完成，或者高負荷的發(fā)酵活動，特別是高精料、高谷物、高淀粉性質的日糧，特別容易產生酸中毒，影響瘤胃微生物活性和微生態(tài)系統(tǒng)，無法保證瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)完整性。高產狀態(tài)下的動物更容易產生應激，影響瘤胃微生物和微生態(tài)系統(tǒng)。需要外源微生物或者酶制劑的幫助。反芻動物酶制劑添加的3個前提：一是需要輔助解決保證一定量粗飼料消化問題；二是需要維護和保證瘤胃微生物的生物活性與微生態(tài)問題；三是需要解決高產奶牛需要高能量谷物投入容易造成酸中毒問題。

反芻動物飼料酶的復雜性是由兩方面決定的。一是反芻動物消化道的復雜性，特別是瘤胃的復雜性。瘤胃是一個天然的“生物發(fā)酵與合成反應罐”：①能夠分解消化大分子營養(yǎng)物質；②能夠分解脫毒有機有害成分；③能夠合成營養(yǎng)成分（氨基酸、營養(yǎng)肽、維生素、揮發(fā)性脂肪酸等）；④產生生物活性成分（酶、功能肽、功能寡糖、后生元等）；⑤能夠產生理化影響因子（有機酸、纖維類產物等）。但是，瘤胃也是條件敏感的消化道器官和微生態(tài)系統(tǒng)，容易受到日糧成分及本身代謝造成的理化因素的影響。

二是源于反芻動物飼料原料與單胃動物日糧相比的復雜性，體現在物理特性和化學特性兩方面。物理特性是飼料原料，特別是粗飼料不同成分的空間結構與嵌合方式和程度等?；瘜W特性是飼料原料同一類成分的組成單位的差異與主鏈長短及支鏈分布形式等。

這些復雜性體現在高產奶牛更明顯，與一般的肉牛肉羊等反芻動物不同，奶牛高產是一個連續(xù)性高投入高產出過程，需要外源手段實現。同時，奶牛一般有消化道疾病和代謝病及利用年限等問題，代謝病容易影響奶牛產奶和產奶周期。日糧不平衡和富營養(yǎng)，特別是高淀粉、高精料日糧，容易影響瘤胃微生物構成和活性，造成微生態(tài)系統(tǒng)的紊亂，影響動物健康，影響奶牛的利用年限。

2 反芻動物酶制劑技術體系的構建

傳統(tǒng)的單酶和復合酶及其技術體系可能滿足單胃動物的需要，無法滿足反芻動物的需要。實際上，反芻動物中外源性酶制劑的作用模式是非常復雜的，在這方面需要大量的研究。加拿大農業(yè)與農業(yè)食品Lethbridge 研究中心McAllister 等（2001）在討論反芻動物添加飼料酶制劑時就指出：“學者將來的任務是闡明外源性酶制劑的作用模式，這種作用模式可以是一個，也可以是多種的組合，使得外源性酶制劑能更好地改善飼料效率，增加生長和奶產量”。

多年來，我們一直致力于構建飼料酶制劑的技術體系（馮定遠等，2011、2020），但主要是單胃動物基礎的飼料酶制劑技術體系。反芻動物飼料酶制劑，特別是奶牛酶制劑需要一個新思路或者新理論，我們構建的這個體系正是由多個作用模式組成，而且不同作用模式是可以組合的。我們提出的反芻動物酶制劑技術體系包括4 個作用模式：①解決粗飼料消化問題，需要一個多酶系統(tǒng)的集合，可以稱之為“集合酶”模式，包括多種酶來源的復合酶、組合酶或者配合酶；②保證瘤胃微生態(tài)健康，需要一個外源酶與內源菌協(xié)同，或者稱之為“酶菌同構”模式，包括提供能夠產生一些原位益生元的酶制劑，有利于瘤胃微生物的繁殖和活性維護；③體外酶制劑粗飼料預處理與日糧精料添加酶在體內起作用結合，體外酶部分解決消化問題，體內酶解決瘤胃微生物營養(yǎng)與微生態(tài)問題及消化道健康（特別是酸堿中毒和酮病等），就是“內外酶結合”模式，體外主要是粗飼料如青貯原料的酶處理；四是使用“過瘤胃酶技術”模式，小腸中外源性酶制劑可以通過降低小腸食糜黏度或者水解瘤胃未能消化的底物，從而改善營養(yǎng)物質的吸收，主要是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，是小腸酶的補充。

我們可以把反芻動物飼料酶制劑技術方案概括為“四位一體、組合運用”，“四位一體”就是都圍繞飼料原料與瘤胃微生物互作，通過直接和間接方式，提高瘤胃微生物的作用效率；“組合運用”是4個作用模式可以是單獨一個，也可以是2～4 個的組合，具體根據動物的種類、發(fā)育階段、生產周期、日糧類型等，例如低產或者停止泌乳的奶牛，使用簡單的復合酶或者配合酶就可以了，只有圍產期的高產奶牛，才可能需要同時考慮4 個模式的酶制劑應用：即粗飼料原料酶預處理+分解復雜原料的酶制劑集合+過瘤胃酶（包被處理）+產生益生元酶制劑（如阿魏酸酯酶等輔效酶）。

圖1 反芻動物酶制劑技術體系

反芻動物酶制劑的“粗料酶預處理與精料添加酶結合”方案就是酶制劑處理粗飼料，在精飼料中也使用酶制劑，后者類似單胃動物使用酶制劑，一般是在反芻料TMR 加入單酶，或者復合酶、組合酶等，這是目前反芻用酶的一般做法。由于反芻動物使用大量的粗飼料，也可以在粗料中使用酶制劑進行預處理，特別是使用纖維素酶和其他NSP酶，更常見是青貯料使用酶制劑，操作更方便，許多反芻用酶的試驗也是酶制劑處理青貯料，并取得良好的效果，提高了干物質、粗纖維的消化率。外源性酶制劑在未被動物采食之前，就已經開始了對飼料的消化，能改善反芻動物瘤胃內的消化，減少下部消化道中飼料的消化率。酶制劑作用效果與其使用方法有關，將酶制劑噴到混合日糧中不能增加奶產量，而應用到精料中則可以增加奶產量（Beauchemin 等，1998）。粗料預處理（需要一定的條件，包括處理水分、處理時間等）和精料直接使用是比較合適的措施，簡單的粗料與精料混合時使用酶制劑則沒有什么效果。

反芻動物酶制劑的“過瘤胃處理酶制劑”方案是考慮一部分營養(yǎng)在消化道后段（小腸）的消化不夠充分，而部分酶制劑在瘤胃不能夠發(fā)揮作用，但在瘤胃中被破壞滅活。通過過瘤胃技術，特別是酶制劑包被技術，讓酶制劑到達小腸才釋放發(fā)揮作用。一般是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。也可以使用一些包被的NSP 酶，到小腸降低食糜的黏性，間接改善后段消化道對營養(yǎng)物質的吸收。對于酶改善生產性能的作用，至少一部分是因為對瘤胃或瘤胃后的消化的改變引起的（McAllister 等，2001）?！斑^瘤胃飼料酶制劑”類似單胃動物酶制劑，但又不同。一是協(xié)助消化道后段酶消化降解飼料營養(yǎng)；二是降解飼料殘留抗營養(yǎng)因子或有害成分；三是協(xié)助消化降解瘤胃細菌產生的營養(yǎng)；四是降解瘤胃細菌失活產生“后生元”（postbiotics）。過瘤胃后酶制劑的作用，外源性酶制劑不僅增加了瘤胃中纖維降解活性，而且增加了小腸中纖維的解降活性（Hristov 等，1998a，b，2000），這種現象在木聚糖酶活性表現得更為明顯，外源性酶制劑的添加增加了十二指腸木聚糖酶的活性約30%（Hristov等，1998a）。

圖2 過瘤胃酶制劑的功能

在反芻動物飼料酶制劑技術體系的4個方案中，下面重點討論“集合酶”方案與“酶菌同構”方案。

3 反芻動物酶制劑技術體系的“集合酶”方案

根據反芻動物的飼料特性、動物生理生產階段、生產性能需要，把我們提出的飼料酶制劑的單酶、復合酶、組合酶、配合酶等理念（馮定遠等，2019）進行集合，作為一個整體考慮，或者是多種解決復雜原料酶制劑方案的一個集合（簡稱“集合酶”）?！凹厦浮辈幌瘛皬秃厦浮薄敖M合酶”等是一種產品，而是一種技術方案。特別是把組合酶與配合酶的協(xié)同，形成一個集合酶系統(tǒng)，綜合考慮飼料物料復雜的物理結構與多樣的化學組成，最大程度解決消化的高效問題。

圖3 模擬天然“多酶系統(tǒng)”的飼料酶集合

反芻動物對外源性酶制劑的反應，是多因素的綜合。常見反芻動物酶制劑，主要是基于降解植物細胞壁而制作的酶，主要是纖維素酶和木聚糖酶。但這些商品酶制劑不是由單一酶構成，不同程度有第二種酶活性（如淀粉酶、蛋白酶、果糖酶）存在，是一種天然的組合酶和配合酶。纖維素和半纖維素的降解需要很多酶，這些商品酶制劑中各種單一酶的相對比例和活性組成不同，會影響其效果。甚至一種微生物，因菌株選擇及底物和培養(yǎng)基不同，而產生的酶的類型和活性變化很大（Considine 等，1989；Gashe，1992）。根據飼料不同添加相應酶制劑，并非所有酶制劑對消化復雜碳水合物（如紫花苜蓿和大麥）都是同樣有效的。對具有過于復雜的結構的飼料原料，過去缺乏關于其限制飼料消化率和飼料消化程度的了解，這使得酶制劑工程設計生產對付抑制飼料消化的酶制劑無從下手，現在情況已經大大改變了。

對有些飼料酶作用的特異靶底物是可以鑒別的，比如在玉米的蛋白中包含著淀粉顆粒，使得淀粉本身的特性（供能）未能發(fā)揮出來，限制了其中淀粉的降解（McAllister 等，1993）。因此設計的外源性酶應能消化這種蛋白質鏈矩陣，以釋放淀粉顆粒，能夠被瘤胃或宿主的內源性酶消化。含有淀粉酶（但不含有蛋白酶）的外源性酶制劑并不能顯著提高反芻動物對玉米的利用率（McAllister 等，2001）。這就需要我們提出的配合酶（馮定遠等，2019），就是在物理空間有特定關聯的幾種酶制劑的配合，如同時有淀粉酶、蛋白酶等才能完成對玉米的消化利用。對秸稈來說，微生物消化的主要障礙是硅土、蠟質和角質（Bae 等，1997），角質酶也可能是一種輔效酶。

4 反芻動物酶制劑技術體系的“酶菌同構”方案

反芻動物作為一類特別的物種，瘤胃是其草食性、耐粗性的基礎。不僅能夠消化粗纖維、低質蛋白，同時能夠利用C、N、H、P、S 等元素合成糖、氨基酸、部分維生素（B 族、K 等），以及生物活性物質（酶、激素、有機酸等）。瘤胃是一個功能多樣、高效的“天然發(fā)酵與合成反應罐”。但瘤胃具有的數量眾多復雜的菌群和微生態(tài)系統(tǒng)，一個流動易變消化器官系統(tǒng)，對物理、化學、生物等條件非常敏感，溫度、酸度、滲透壓、電解質、有害或者抗營養(yǎng)成分等都會影響發(fā)酵合成罐的效率，更嚴重時影響系統(tǒng)的完整性?；谶@兩方面，“酶菌同構”的出發(fā)點是兩個：輔助消化與維護條件，酶制劑幫助消化，減少瘤胃微生物的負擔；酶制劑產生有益成分，提供細菌需要成分和維護理化環(huán)境。考慮外源酶制劑的輔助性消化，在高投入時微生物消化超負荷時尤其如此；外源酶降解產物為微生物提供營養(yǎng)底物，維系良好的微生物活性與微生態(tài)平衡，應用我們提出的主效酶與輔效酶，外源性酶制劑對胃腸道微生物菌落和反芻動物本身均有很多作用。

圖4 “酶菌同構”作用模式的機理

反芻動物酶制劑技術體系的“酶菌同構”的內容包括3 個方面：①酶輔助瘤胃微生物消化復雜日糧。通過外源添加酶制劑，協(xié)同幫助瘤胃微生物消化功能，特別是高產奶牛高采食量、高營養(yǎng)情況下，有針對性地結合復合酶、組合酶、配合酶，進行外源酶制劑的集合。解決大量、難消化飼料的消化，減輕瘤胃微生物消化的負擔。米曲霉的浸提物與瘤胃微生物浸提液協(xié)同提高從干草中釋放的可溶性糖量（Newbold，1995）。已經證實阿拉伯木聚糖與p-香豆酸基和阿魏酸基的交叉連接程度，是限制植物細胞壁消化的一個因素（Hatfield，1993），米曲酶可以產生一種酯酶，這種酯酶能打破p-香豆酸和阿魏酸與阿拉伯木聚糖之間形成的酯橋（Tenkanen 等，1991），這與瘤胃微生物在功能上有協(xié)同作用（Varel 等，1993）。實驗室培養(yǎng)的細菌可能有幾種瘤胃纖維素分解菌（如梭菌屬、瘤胃球菌）（Forster 等，1998）。這些正是產生消化植物細胞壁必須具有的不同酶活性所需要的微生物。外源性酶制劑可以增加瘤胃纖維消化率和總胃腸道纖維消化率，這進一步證實了上述作用（Yang 等，1999）。特別是難消化飼料、高纖維日糧更明顯，外源性酶制劑改善了飼喂大麥日糧的奶牛飼料轉化率，而沒有改善飼喂玉米日糧飼料轉化率，這是因為大麥的纖維含量高（Beauchemin 等，1997）。瘤胃中外源性酶制劑可直接作用于飼料，也可以通過與瘤胃微生物的協(xié)同作用間接刺激消化活性（McAllister等，2001）。

②酶調節(jié)瘤胃理化環(huán)境。維持瘤胃的良好的理化環(huán)境非常重要，特別是使用高精料時，淀粉類在異常發(fā)酵情況下，容易產生酸中毒。淀粉酶、糖化酶等，讓可溶性糖水解直接吸收（如葡萄糖），減少淀粉類發(fā)酵產生丙酸、乳酸等，影響瘤胃作為天然發(fā)酵罐的功能，酸中毒影響微生物的活性，也影響瘤胃組織功能，對于需要維持比較長的利用年限的奶牛特別重要（相對而言，肉牛、肉羊考慮比較少）。對于高濃度的低纖維日糧而言，纖維分解酶顯著改善了飼喂高谷物日糧的牛的飼料消化率（Krause 等，1998）和生產性能（Beauchemin等，1997；Iwaasa 等，1997）。對此種現象的解釋，在于比較瘤胃生物產生的纖維分解酶需要的最佳pH 環(huán)境，和由厭氧性真菌產生的纖維分解酶所需要的最佳pH 環(huán)境。pH 低于6.2 時，抑制纖維分解菌的生長（Russell 等，1980），纖維消化率大大降低（Hoover等，1984）。許多瘤胃微生物本身功能產生的纖維分解酶的最佳pH 超過了6.2（Greve 等，1984；Matte等，1992）。如果外源酶制劑與瘤胃微生物有協(xié)同作用，則更能提高瘤胃對纖維的消化。表明外源性酶制劑具有媒介活性，這種活性在降解植物細胞壁上受到瘤胃微生物的限制。植物細胞壁在瘤胃內的消化受到限制可能是因為瘤胃微生物所產生的酶的類型和量不足、降解酶不能與底物很好地互作或者瘤胃中的狀況并非酶發(fā)揮作用的最佳條件（如瘤胃pH過低等）。

③酶產生微生物需要的益生元。單胃動物方面，外源酶制劑影響仔雞腸道菌群發(fā)生了變化（Hock等，1997；Vahjen 等，1998）。部分酶產物成為瘤胃微生物的益生元，酵母細胞壁是近年來在反芻動物特別是奶牛應用比較多的產品，其中一個重要作用是提供瘤胃微生物需要的營養(yǎng)底物。酶制劑具有益生功能，我們專門提出了“益生型酶制劑”的理念（馮定遠等，2020），就是酶制劑的降解產物，部分可以作為腸道微生物的益生元，調節(jié)腸道健康和微生態(tài)正常。這方面真正有重要價值的是在反芻動物腸道微生物，特別是瘤胃的細菌營養(yǎng)底物，米曲霉的浸提物能增加瘤胃細菌的數量（Newbold等，1992a，b）。木聚糖酶能夠將日糧的木聚糖原位產生瘤胃細菌需要的益生元（主要是木寡糖），但是一些復雜的木聚糖，特別是玉米等來源的木聚糖，由于含有支鏈或者側鏈，影響了木聚糖酶發(fā)揮作用，需要使用一些我們稱之為“輔效酶”的酶制劑，如阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶，與主效酶（木聚糖酶）配合，才能降解木聚糖酶，產生細菌需要的益生元。這些已被雷釗（2017）和鄭達文（2019）在單胃動物試驗所證實。生物技術進展很快，纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等已被廣泛應用，但是我們提到的反芻動物酶制劑技術體系其他重要的酶，如阿魏酸酯酶、角質酶、乙酸基木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶等“輔效酶”還沒有被充分認識。

反芻動物飼料酶制劑技術體系除了以上4 方面方案外，還需要有特別的評價體系，特別是多年生產的奶牛，與一般單胃動物不同，不能僅僅考慮常規(guī)的生產性能指標，還需特別注意兼顧瘤胃健康、消化道健康和整個動物機體的健康，減少酮病等代謝類疾病。以奶牛為例，評價飼料酶制劑效果的指標應該包括兩方面：一是生產性能，包括產奶量、牛奶質量、飼料效率；二是健康與利用年限，包括瘤胃微生物生物量與活性、代謝病指標、奶牛產奶周期與利用年限等。其中一個指標明顯就是有價值的奶牛飼料用酶，至于經濟價值就需要考慮酶制劑的成本了。

總之，反芻動物瘤胃消化道的特點和復雜性（如有很多微生物菌落，能產生很多內源性酶制劑），使得外源酶制劑在反芻動物體內的作用機制更加復雜。必須考慮酶作用的靶底物，設計特異的復合酶，或者組合酶、配合酶，甚至是各種酶、各類酶的集合，并且是依據特定粗料、干草、目標底物的成熟程度以及結構性障礙而設計，特別考慮外源酶對體內酶特別是瘤胃微生物酶的補充、外源酶產生原位益生元維持瘤胃微生態(tài)、多種形態(tài)酶制劑的集合解決的復雜飼料原料消化、大體積粗飼料的酶預處理結合精飼料的酶制劑添加、過瘤胃技術讓部分酶制劑在瘤胃后段腸道發(fā)揮功效等作用模式。提出有別于單胃動物的反芻動物飼料酶制劑技術體系，就是基于反芻動物瘤胃的復雜性和粗飼料的粗劣性，該體系包括4個作用模式：“體外酶預處理與體內添加酶結合”“過瘤胃酶處理”“集合酶”“酶菌同構”方案。這些方案“四位一體、組合運用”，這些作用模式及技術方案并不需要同時考慮，在不同條件下可以組合，同時，施加了這些方案也不一定達到期望的生產效果，這是一種潛力和可能性，高產奶牛的產奶前期應用效果更明顯。