胡淑鸞 過貴元

（福建漳州衛(wèi)生職業(yè)學院，福建 漳州 353600）

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR）是成人視力喪失和視力障礙的主要原因[1]。Müller 細胞是視網(wǎng)膜主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞，起著保護、支持神經(jīng)細胞作用，其在高糖環(huán)境下可以促進VEGF 和纖維化因子的表達從而加重DR 的病變等[2-4]。本研究通過測量Müller細胞不同程度的高糖培養(yǎng)條件下生長活性的變化，推測Müller 細胞在糖尿病性視網(wǎng)膜病變進展中的活性變化，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 Müller 細胞的培養(yǎng)：取約14周齡成年雄性大耳白兔，處死后無菌剪取周邊視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，將視網(wǎng)膜剪成1mm×1mm 小塊后置于培養(yǎng)瓶中，間隔約5mm，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1h 后，加入少許20%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，第2天加入足量同樣培養(yǎng)液，培養(yǎng)7d 后通過彎頭吸管反復輕輕吹打培養(yǎng)的組織塊使其解體后，置換上新鮮培養(yǎng)液，每4d 換一次液直至細胞達80%以上融合后，0.25%Trypsin-EDTA 消化 10min 后加入含胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液，吹打成細胞密度約104/mL 懸浮液，取等量的細胞懸浮液置入含有玻片的12 孔培養(yǎng)板或96 孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)（不同濃度、不同培養(yǎng)時間均設有 4 孔）；在 2d、4d、6d 置換上等量含有不同條件（A：正常組、B：10mmol/L、C：25mmol/L、D：50mmol/L 的 4個組） 的無血清培養(yǎng)液，第7 天取出培養(yǎng)板進行進一步實驗研究。

1.2 兔視網(wǎng)膜Müller 細胞鑒定：①顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)條件下的細胞生長形態(tài)；②熒光免疫組化染色標記：取培養(yǎng)于含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的細胞玻片，PBS 清洗，4% Polysorbate 固定液 30 min，0.1% TritonX-100 10 min，0.3% H2O2甲醇溶液30 min，10% 正常山羊血清 20 min；加入兔抗GFAP 和抗CRALBP 抗體，對照組加PBS，37℃孵育1h 后清洗；加入相應的熒光二抗，室溫避光1h，PBS 清洗后DAPI 染色 15 min?？篃晒獯邷绶馄瑒┻M行封片處理。熒光顯微鏡下觀察及拍照；③透射電鏡：原代細胞經(jīng)0.25%Trypsin-EDTA 消化、離心成細胞團，3%Glutaraldehyde～1.5%Polysorbate-0.1MPBS 固定 4h，1%Osmium tetroxide ～1.5%Potassium ferrocyanide 后固定 2h，618 包埋劑包埋，薄切片機切 70～80 nm 的薄片；Uranyl acetate 染色、Lead citrate 染色，清洗；通過透射電鏡進行觀察及攝片。

1.3 細胞活性測定（MTT 法）：第7 天取出不同培養(yǎng)條件的 96 孔培養(yǎng)板，A：正常組、B：10mmol/L、C：25mmol/L、D：50mmol/L 的 4個組，培養(yǎng)天數(shù)分別為1d、3d、5d，每組內(nèi)不同培養(yǎng)時間設置4個平行孔；加入20μL MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出，棄上清液后加入100μL DMSO，振蕩，待沉淀物溶解充分后，置于波長設定為490nm 的酶聯(lián)免疫檢測儀，檢測培養(yǎng)板各孔的光吸收OD 值。

1.4 統(tǒng)計學處理：運用SPSS 11.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Müller 細胞的鑒別：兔周邊視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)約3d，培養(yǎng)塊周邊可見有細胞突起伸出，培養(yǎng)7d見組織塊周圍長滿細胞，呈放射狀，細胞在培養(yǎng)3周后見細胞生長形態(tài)穩(wěn)定并粘附與整個培養(yǎng)瓶瓶底。培養(yǎng)的細胞在熒光免疫組化標記處理后RALBP、GFAP、細胞核分別呈綠色、紅色、藍色，RALBP、GFAP 陽性率均95% 以上。通過電鏡觀察，Müller 細胞膜上有豐富微絨毛，胞漿內(nèi)含有豐富線粒體、微絲、核糖體、糖原顆粒、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，細胞核較大，常有多核仁。

2.2 兔視網(wǎng)膜Müller 細胞活性：①培養(yǎng)1d，濃度為25mmol/L、50mmol/L 葡萄糖組較對照組平均光吸收OD 值高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并隨濃度的增加，其OD 值增加；②培養(yǎng)天數(shù)3d、濃度10mmol/L 葡萄糖組所測得的OD 值較對照高（P<0.05），而濃度為25mmol/L、50mmol/L 葡萄糖組較對照組無顯著變化，其隨著濃度增加呈下降趨勢；③第5 天時高濃度組的OD 值與對照組對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），均隨著濃度增加呈下降趨勢；④培養(yǎng)天數(shù)3d、5d 組，高糖各組測得的OD 值明顯低于培養(yǎng)1d（P<0.05），并呈現(xiàn)出遞減性下降，詳見表1。

表1 不同濃度葡萄糖各組Müller 細胞的OD 值 （）

表1 不同濃度葡萄糖各組Müller 細胞的OD 值 （）

注：與正常組比較*為P<0.05，**為P<0.001；葡萄糖組內(nèi)與培養(yǎng) 1 天組比較 △為 P<0.05，△△為 P<0.001

葡萄糖濃度（mmol/L） 樣本數(shù) 時間（d）1 3 5 F 值 P 值對照組 4 0.83±0.03 0.82±0.05 0.83±0.070.057 0.945 10 4 0.96±0.07 0.93±0.05* 0.87±0.02△ 3.552 0.073 25 4 0.99±0.06* 0.83±0.06△ 0.74±0.04*△△ 22.797 0.000 50 4 1.05±0.08* 0.79±0.05 0.74±0.05**△△ 28.645 0.000 F 值 6.732 5.859 9.429 P 值 0.006 0.011 0.002

3 討論

DR 為致盲率較高的糖尿病并發(fā)癥，其主要是高血糖引起視網(wǎng)膜血循環(huán)障礙：微血管自我調(diào)節(jié)功能紊亂、異常的血流變，視網(wǎng)膜各層細胞組織變性從而造成視功能障礙等[5-6]。本研究通過模擬糖尿病時體內(nèi)微環(huán)境，設置濃度為10mmol/L、25mmol/L、50mmol/L 體外高糖狀態(tài)培養(yǎng)條件，通過測定各不同程度的高糖環(huán)境、培養(yǎng)天數(shù)組的平均光吸收OD值，其高糖組的Müller 細胞的活性早期呈現(xiàn)增強狀態(tài)，而當高濃度葡萄糖作用時間延長后，顯微鏡下見Müller 細胞形態(tài)逐漸出現(xiàn)改變，其所測得OD 值提示生長出現(xiàn)減弱，并與濃度高低相關(guān)：濃度增加，抑制作用更為明顯。我們推測高血糖可刺激Müller細胞增殖而加速糖尿病性視網(wǎng)膜病變的增殖病理進程，如果血糖長時間存在較高或病情延長，此時Müller 細胞的活性受到影響，再生增殖能力減弱以至于數(shù)量減少到不能維持正常生理功能，亦能加重糖尿病性視網(wǎng)膜病變各種病理變化。