李 梅，安小婭，裴浩宇，白福霞，王 剛，王延濤，于 杰，黨瑞華*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.山東東阿阿膠公司，山東 東阿 252299)

生長(zhǎng)性狀是畜牧業(yè)生產(chǎn)中關(guān)注的一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，是衡量育種價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)，尋找相關(guān)的分子標(biāo)記可以縮短對(duì)生長(zhǎng)性狀的育種年限。SNP是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。對(duì)于SNP的研究方法有毛細(xì)管電泳、變形高效液相色譜(DHPLC)、質(zhì)譜分型等，質(zhì)譜分型的發(fā)展基于20世紀(jì)80年代產(chǎn)生的一些新的軟電離方式，包括電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(matri-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS)等，目前國(guó)外已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道生物質(zhì)譜在SNP分型方面的應(yīng)用，主要采用MALDI-TOFMS方法[1]。

Sirtuins家族是廣泛存在于地球所有生命形態(tài)中的具有共同催化結(jié)構(gòu)的古老蛋白質(zhì)，在包括細(xì)菌、針具、酵母菌、瘧原蟲、后生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物甚至病毒等生命體中都廣泛保守[2-4]。編碼該酶家族的類sirtuin基因包括SIRT1、SIRT2和SIRT3，是組蛋白去乙酰化酶家族中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴性家族成員，在衰老、代謝和凋亡中發(fā)揮重要作用[5]。SIRT3[沉默配對(duì)型信息調(diào)節(jié)3(silent mating-type information regulation 3)]是SIRT3編碼sirtuin家族III類組蛋白去乙?；福ㄎ挥诰€粒體基質(zhì)中[6]，可通過(guò)去乙?；€粒體中與ATP生產(chǎn)相關(guān)的酶從而調(diào)劑ATP的生成[7]。2010年Zhao等[8]通過(guò)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)，參與三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)和脂肪酸的β氧化等代謝的蛋白質(zhì)可被乙?；揎棧诰€粒體中大約1/5的蛋白質(zhì)可被乙?；Y(jié)合SIRT3的活性，SIRT3可通過(guò)調(diào)控線粒體蛋白質(zhì)乙酰化水平來(lái)參與代謝活動(dòng)。因此，SIRT3可通過(guò)調(diào)節(jié)呼吸鏈、三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生以及檸檬酸和尿素循環(huán)在調(diào)節(jié)能量代謝和衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用，于代謝旺盛的組織如肌肉、褐色脂肪、腎臟、肝臟、腦和心臟等富含線粒體的組織器官中表達(dá)較高[9]。敲除SIRT3基因會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的線粒體過(guò)度乙酰化，造成細(xì)胞能量代謝及有絲分裂過(guò)程發(fā)生異常[10]。

王海濤等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3在骨骼肌中也高表達(dá)，參與能量代謝并影響機(jī)體的衰老、細(xì)胞死亡和腫瘤發(fā)生，且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，適度的運(yùn)動(dòng)會(huì)增加骨骼肌中的SIRT3含量并進(jìn)一步影響脂肪代謝。有研究[12]表明，SIRT3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響SIRT3的轉(zhuǎn)錄活性，從而改變?nèi)馀＜?nèi)脂肪含量，且SIRT1和SIRT2基因的基因型組合對(duì)秦川牛眼肌面積和肌間脂肪有顯著影響。在心臟、肝臟和腎臟等代謝旺盛的組織中，ATP水平較高，且SIRT3也具有較高的表達(dá)水平，由此推測(cè)SIRT3的表達(dá)有利于ATP的生成，從而用于機(jī)體的運(yùn)動(dòng)代謝等，使得機(jī)體相應(yīng)部位相對(duì)發(fā)達(dá)，所以和動(dòng)物的體尺性狀有一定的關(guān)聯(lián)[13]。

目前關(guān)于SIRT3基因的多態(tài)性研究較少，在動(dòng)物體尺性狀方面僅在秦川牛上做了相關(guān)研究，而未見(jiàn)關(guān)于驢的相關(guān)報(bào)道，鑒于SIRT3基因在能量代謝和脂質(zhì)代謝過(guò)程中的重要作用，我們推測(cè)其在驢的生長(zhǎng)性狀方面可能有直接或間接地作用。因此，本研究擬以SIRT3基因?yàn)槟繕?biāo)基因，采用質(zhì)譜分型方法，分析不同標(biāo)記基因型與德州驢生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)系，以期為德州驢分子育種提供可參考的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

血樣采自山東省德州市東阿阿膠公司驢場(chǎng)，選擇同等飼養(yǎng)條件下的30月齡以上健康的214頭公驢、190頭母驢。對(duì)每頭驢頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(ACD)∶V(血液)=1∶6)，置于-80 ℃保存。同時(shí)采集試驗(yàn)驢的9個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)(體高、體長(zhǎng)、胸圍、胸寬、胸深、管圍、尻長(zhǎng)、尻寬、尻高)。

1.2 基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用常規(guī)的苯酚—氯仿提取法[14]提取德州驢血樣基因組DNA，提取的DNA用TE緩沖液處理后，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，用分光光度計(jì)檢測(cè)D260/D280值，放入-20 ℃保存?zhèn)溆?，在使用時(shí)稀釋至50 ng/μL，保存在4 ℃。

1.3 SIRT3基因多態(tài)性鑒定、基因分型

根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的驢SIRT3序列(GenBank NC_19763和NC_35148)，針對(duì)編碼區(qū)利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物均由上海生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系25 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 12.5μL，ddH2O 9.5 μL，上游、下游引物各(10 pmoL/μL)1.0 μL，模板DNA(50 ng/μL)1.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s(引物序列及退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將所有個(gè)體DNA稀釋到適宜濃度并送往康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分型。每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)選取20個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用SeqMan軟件進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 SIRT3-1和SIRT3-2位點(diǎn)的引物信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel對(duì)基因遺傳變異質(zhì)譜分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用哈代—溫伯格平衡檢驗(yàn)軟件對(duì)2個(gè)突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率和哈代—溫伯格平衡(HWE)進(jìn)行了分析。同時(shí)，運(yùn)用在線軟件(http:///www.msrcall.com/)估算純合子(Ho)、雜合子(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)。使用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalases)檢測(cè)位點(diǎn)之間的連鎖不平衡強(qiáng)度，采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析分析德州驢基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示(P<0.05為差異顯著水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 德州驢SIRT3基因的多態(tài)性檢測(cè)

隨機(jī)選取德州驢的DNA樣本作為SIRT3-1和SIRT3-2位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增模板，產(chǎn)物加入濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。同時(shí)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證。在SIRT3-1(g.19763T>C)發(fā)現(xiàn)了TT、TC、CC 3個(gè)基因型，在SIRT3-2(g.35148A>G)發(fā)現(xiàn)了AG、GG 2個(gè)基因型，測(cè)序結(jié)果如圖1。將404頭德州驢的DNA樣品送到康普生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，SIRT3-1和SIRT3-2位點(diǎn)分型結(jié)果如圖2所示。

2.2 群體遺傳學(xué)分析、連鎖不平衡分析

從群體遺傳學(xué)角度分別分析這2個(gè)SNPs的基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)檢測(cè)Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，結(jié)果如表2、表3所示。SIRT3-1位點(diǎn)上，TC基因型頻率最高，PIC范圍約為0.30，說(shuō)明母驢和公驢具有中度多態(tài)性(0.250.05)。

表2 德州驢SIRT3-1位點(diǎn)基因型、等位基因頻率及群體遺傳參數(shù)

表3 德州驢SIRT3-2位點(diǎn)基因型、等位基因頻率及群體遺傳參數(shù)

在連鎖不平衡分析中，連鎖強(qiáng)度的大小可以用D’和r2表示。r2<0.33表示SIRT3-1和SIRT3-2沒(méi)有連鎖關(guān)系，如圖3。

2.3 SIRT3基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)德州驢214頭公驢和190頭母驢的9個(gè)生長(zhǎng)性狀分別與SIRT3基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)不同基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。在SIRT3-1位點(diǎn)，公驢和母驢的TT型個(gè)體在體高和尻長(zhǎng)方面均顯著性高于TC型個(gè)體均值(P<0.05)，即公母驢存在一致的顯著性差異。此外，公驢中TT型個(gè)體均值在尻高方面也顯著高于TC型個(gè)體均值(P<0.05)，而CC型個(gè)體均值在管圍方面顯著高于TT型個(gè)體均值(P<0.05)(如表4)。在SIRT3-2位點(diǎn)，公驢和母驢GG基因型個(gè)體均值在胸寬方面顯著高于AG型個(gè)體均值(P<0.05)，公驢GG型個(gè)體均值在尻寬方面極顯著高于AG型個(gè)體均值(P<0.01)(如表5)。

表4 德州驢SIRT3-1位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

表5 德州驢SIRT3-2位點(diǎn)多態(tài)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

Shi等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可被寒冷刺激誘導(dǎo)并在棕色脂肪組織中表達(dá)冷暴露會(huì)增加小鼠棕色脂肪SIRT3 mRNA水平，靜息狀態(tài)下骨骼肌70%的能量來(lái)源于脂肪的分解代謝，由此可推測(cè)骨骼肌中SIRT3的表達(dá)對(duì)脂肪代謝具有重要影響。

研究[16-24]表明，SIRT3基因的突變位點(diǎn)與大圍子豬和湖村黑豬的肉質(zhì)性狀存在顯著性相關(guān)，表現(xiàn)為在SIRT3基因第5外顯子上存在的SNP突變位點(diǎn)顯著影響大圍子豬的24 h滴水損失、失水率和肌內(nèi)脂肪含量(P<0.05)。Gui等人[5]對(duì)SIRT1、SIRT2和SIRT3 3個(gè)基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)與牛的體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)僅有SIRT1的基因變異及其相應(yīng)的基因型可以作為牛育種經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記。鄧冠群等[10]人對(duì)秦川牛SIRT3基因的研究表明，不同位點(diǎn)的不同基因型與體斜長(zhǎng)、體高、腰角寬、尻長(zhǎng)、胸深、胸圍、背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪含量顯著(P<0.05)或極顯著相關(guān)(P<0.01)。

本試驗(yàn)通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)190頭母驢、214頭公驢共404頭德州驢的SIRT3基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。通過(guò)基因分型在SIRT3-1發(fā)現(xiàn)3種基因型，而SIRT3-2只有兩種基因型，這可能與試驗(yàn)中選擇的群體過(guò)小或者在進(jìn)化過(guò)程中自然和人為定向選擇有關(guān)。相對(duì)于外顯子區(qū)域的突變，越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)含子區(qū)域的突變也能對(duì)性狀產(chǎn)生顯著的影響。雖然內(nèi)含子的突變不會(huì)對(duì)編碼的氨基酸序列發(fā)生影響，但其可能對(duì)順式作用元件的功能產(chǎn)生影響或者改變細(xì)胞內(nèi)mRNA的可變剪切，進(jìn)而對(duì)基因的功能或者表達(dá)產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)SIRT3基因在德州驢中存在多態(tài)且與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)，德州驢群體中SIRT3基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)與體高、尻高、尻長(zhǎng)、胸寬這4個(gè)生長(zhǎng)性狀有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明SIRT3基因多態(tài)有潛力作為影響生長(zhǎng)性狀的候選分子標(biāo)記用于輔助選擇，這為德州驢的選育工作提供了科學(xué)依據(jù)。