白福霞，李 梅，裴浩宇，安小婭，王 剛，王延濤，于 杰，黨瑞華*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.山東東阿阿膠公司，山東 東阿 252299)

生長/分化因子-10(GDF10)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族的成員，也稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3b(BMP-3b)，與骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(BMP-3)高度相關(guān)，BMP-3b和BMP-3的成熟區(qū)大約80%的氨基酸序列具有同一性[1-2]。最初是從大鼠股骨組織中發(fā)現(xiàn)的一種新型BMP-3相關(guān)蛋白[3-4]。GDF10存在于新生兒和成人骨樣本中，在顱骨中檢測到的水平高于在長骨中檢測到的水平，并且GDF10基因表達與大鼠顱骨中成骨細(xì)胞的分化相關(guān)。因此，GDF10在調(diào)節(jié)參與骨骼形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞分化事件中發(fā)揮重要作用。GDF10不僅在骨骼和發(fā)育中的胚胎中高表達，而且在哺乳動物脂肪組織中表達較高[5]。已有研究表明BMP-3b在脂肪細(xì)胞中表達，以自分泌方式調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，并作為獨特的非共價復(fù)合物由脂肪細(xì)胞分泌，在調(diào)節(jié)小鼠脂肪生成和代謝中具有重要作用[6-8]。GDF10基因多態(tài)位點與南德溫雜交肉牛和甘南牦牛的體斜長、體高和胸圍生長性狀顯著相關(guān)，可以作為牛生產(chǎn)性狀的候選分子標(biāo)記，為牛遺傳資源開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)[9-11]。

目前對于驢重要性狀的分子標(biāo)記主要集中在生長，毛色、毛的長短，乳用及皮用等性狀。Lai等研究結(jié)果表明德州驢肌肉組織中IGF1基因的表達量隨年齡增長而降低。多態(tài)位點和單倍型組合關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，IGF1基因的2個突變位點與德州驢的生長性狀有關(guān)[12]。Wang等發(fā)現(xiàn)TBX3基因內(nèi)含子2中g(shù).3624A>G SNP位點與德州驢體型性狀顯著相關(guān)[13]。ASIP、MC1R、KIT基因可作為毛色候選基因，將驢的毛色區(qū)分開來，可以作為驢品種鑒定和個體識別的重要依據(jù)[14-15]。運用PCR-SSCP方法對疆岳驢PRLR基因側(cè)翼區(qū)進行多態(tài)性分析，PRLR基因突變與泌乳性狀存在關(guān)聯(lián)性，可以作為疆岳驢乳用型選育的分子遺傳標(biāo)記之一[16]。

德州驢形成歷史悠久，以耐粗飼、抗病力強、飼料消耗較少、行動靈活和善于運輸而著稱，其體格高大，結(jié)構(gòu)勻稱，體質(zhì)緊湊、結(jié)實、方正，是我國重要的驢遺傳資源[17]。前期已有試驗結(jié)果表明GDF10基因?qū)ε５纳L性狀具有顯著影響，但是在驢中還缺乏該基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)研究。本研究以德州驢為研究對象，分析GDF10基因在德州驢群體中的遺傳多態(tài)性以及與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，進而得到與生長性狀顯著相關(guān)的遺傳標(biāo)記，用于德州驢的分子標(biāo)記輔助選擇，并為育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

采集山東省東阿阿膠股份有限公司德州驢養(yǎng)殖基地440頭德州驢的血液樣品。并測量其生長性狀的體尺數(shù)據(jù)，其中包括體高、體長、胸圍、胸寬、胸深、管圍、尻長、尻寬、尻高9個生長性狀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)苯酚—氯仿法從頸靜脈采集的血樣中提取DNA，并將DNA樣品保存于-80 ℃。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中驢公開的GDF10基因序列(登錄號：NW_014637621.1)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物，并于北京擎科生物科技有限公司合成，引物相關(guān)信息見表1。

表1 驢GDF10基因PCR擴增引物信息

1.3 PCR擴增與基因分型

PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，包括：2xEs Taq Master Mix 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共30個循環(huán)；在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4 統(tǒng)計分析

根據(jù)群體遺傳學(xué)理論，計算基因型和等位基因頻率，應(yīng)用在線軟件(http://www.msrcall.com/)計算德州驢種群GDF10基因多態(tài)位點的純合度Ho(homozygosity)、雜合度He(heterozygosity)、有效等位基因數(shù)Ne(effective number of alles)和多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)，并檢驗SNP位點是否處于哈迪—溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡狀態(tài)。

利用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析3個SNPs位點間的連鎖不平衡(LD)關(guān)系。并通過SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表明差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF10基因SNPs位點篩選及質(zhì)譜分型結(jié)果

根據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GDF10基因的3′-UTR區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子中共發(fā)現(xiàn)了3個SNP位點，(g.2031481 A>G，g.2041898 A>G，g.2043035 C>T)，3個SNP位點均檢測到3種基因型，測序結(jié)果見圖1。

使用質(zhì)譜分型技術(shù)對檢測到的SNPs位點在德州驢群體中進行基因型分型，g.2031481 A>G和g.2043035 C>T位點分型結(jié)果分別見圖2(a)和圖2(b)。

2.2 驢GDF10基因的群體遺傳參數(shù)分析

由表2可知，g.2031481A>G位點在母驢中的優(yōu)勢基因型為AG，優(yōu)勢等位基因為G，基因頻率為0.682，而在公驢中的優(yōu)勢等位基因型為GG，優(yōu)勢等位基因為G，基因頻率為0.722。g.2041898 A>G位點在母驢和公驢群體中的優(yōu)勢基因型均為AG，優(yōu)勢等位基因均為G，基因頻率分別為0.571，0.580。g.2043035 C>T位點在母驢和公驢群體中的優(yōu)勢基因型均為TC，優(yōu)勢等位基因均為T，基因頻率分別為0.547，0.521。3個SNPs位點均顯示突變后的基因為優(yōu)勢等位基因。卡方檢驗結(jié)果顯示，上述3個SNPs位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 德州驢GDF10基因型頻率、等位基因頻率及哈迪溫伯格平衡檢驗

由表3可知，g.2031481 A>G位點上的遺傳參數(shù)純合度(Ho)的值大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。g.2041898 A>G位點純合度(Ho)的值均大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。g.2043035 C>T位點上純合度(Ho)的值均大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。

表3 德州驢GDF10基因群體遺傳參數(shù)

0.250.50。

2.3 GDF10基因多態(tài)的連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

通過SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis)對德州驢GDF10基因3個SNPs位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖2所示。在母驢和公驢中，rs2(g.2041898 A>G)和rs3(g.2043035 C>T)2個位點間存在強連鎖不平衡(r2分別為0.681和0.792，均大于0.33)。

對GDF10基因的SNPs位點進行單倍型分析，在本實驗群體中各發(fā)現(xiàn)5個單倍型(frequency>0.03)，并標(biāo)記為Hap1-Hap5。母驢中優(yōu)勢單倍型為Hap5，頻率為0.304；而公驢中的優(yōu)勢單倍型為Hap3，頻率為0.339。

表4 驢GDF10基因SNPs位點單倍型構(gòu)建

2.4 GDF10基因多態(tài)的基因型、單倍型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

將德州驢GDF10基因3個SNPs位點的不同基因型與德州驢體高、體長、胸圍、胸寬、胸深、管圍、尻長、尻寬和尻高9個生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，在母驢中，g.2031481 A>G位點AA基因型個體的尻高顯著高于GA基因型個體(P<0.05)；g.2041898 A>G位點AA基因型個體的體高和尻長顯著高于GA基因型個體(P<0.05)；g.2043035 C>T位點CC基因型個體的尻長顯著高于CT基因型個體(P<0.05)。在公驢中，除了g.2043035 C>T位點CC基因型個體的體高顯著低于CT基因型(P<0.05)，其余位點的基因型生長性狀之間并沒有顯著性差異(P>0.05)。

表5 GDF10基因SNPs位點與德州驢生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

目前，GDF10基因的研究結(jié)果較少，主要集中在一些疾病方面和骨骼發(fā)育方面。GDF10基因可以促進中風(fēng)后神經(jīng)修復(fù)[18-19]，此外，這種基因可能充當(dāng)腫瘤抑制因子，并且該基因的表達降低與口腔癌有關(guān)[20]。GDF10基因在小鼠和人股骨組織中均有表達，并在成骨細(xì)胞分化中起重要作用，GDF10基因的缺失會影響胚胎顱骨的發(fā)育[4]。因此，GDF10基因在細(xì)胞分化過程中起重要作用，參與骨骼的發(fā)育和形成。已有研究報道GDF10基因與牛的生長性狀有關(guān)，可以作為牛生長發(fā)育的分子標(biāo)記。在GDF10基因家族的研究中，GDF-8 c.1231C>T多態(tài)性與Kielecka鵝在12周齡時的BW(體重)存在關(guān)聯(lián)[21]。GDF-8基因中的5′UTR區(qū)堿基對的插入缺失與山羊體高、胸寬指數(shù)顯著相關(guān)，特定基因型可能有利于山羊的標(biāo)記輔助選擇(MAS)[22]。GDF-9基因的單核苷酸多態(tài)性對羊的繁殖力性狀有影響，多見于產(chǎn)仔數(shù)方面[23-25]。但是目前為止，關(guān)于GDF10多態(tài)性與德州驢生長性狀的關(guān)聯(lián)分析未見報道。

本試驗以GDF10基因為候選基因，對440頭德州驢進行多態(tài)性檢測，得到了3個SNPs位點。g.2031481 A>G位點突變產(chǎn)生2個等位基因A和G，3種基因型：AA、GA、GG，其中G為優(yōu)勢等位基因，而在母驢和公驢中的優(yōu)勢基因型不一致，母驢中的為AG，公驢中的為GG。g.2041898A>G位點的優(yōu)勢基因為G，優(yōu)勢基因型為GA。而g.2043035 C>T位點優(yōu)勢基因為T，優(yōu)勢基因型為CT。3個位點的優(yōu)勢基因和基因型基本上為突變后的基因。3個位點的遺傳參數(shù)純合度均大于雜合度，且多態(tài)信息含量(PIC)均處于中度多態(tài)(0.25

已有較多的研究表明GDF10基因與骨骼發(fā)育有著重要作用，且與多個中國地方牛品種生長性狀相關(guān)。通過對GDF10基因的3個SNPs位點和德州驢生長性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在母驢中，g.2031481 A>G位點在尻高上表現(xiàn)出顯著性差異；g.2041898A>G位點在個體的體高和尻長上表現(xiàn)出顯著性差異；g.2043035 C>T位點在尻長上表現(xiàn)出顯著性差異。而在公驢中，只有g(shù).2043035 C>T位點顯著影響體高性狀。

GDF10基因多態(tài)性顯著影響德州驢的部分生長性狀，可作為與德州驢產(chǎn)性狀有關(guān)的候選分子標(biāo)記，應(yīng)用于德州驢生產(chǎn)的分子標(biāo)記輔助選擇育種。

4 結(jié) 論

德州驢群體中GDF10基因的3個SNPs位點與部分生長性狀(體高、尻高、尻長)有顯著的相關(guān)性，說明GDF10基因可以作為生長性狀分子輔助選擇的潛在遺傳標(biāo)記，以提高德州驢生長性能。