梁莎莎，龐春英，鄧廷賢，陸杏蓉，段安琴，馬小婭，方艷艷,梁賢威

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

水牛以耐粗飼而著稱，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫高濕、抗病力強(qiáng)和易飼養(yǎng)等特點(diǎn)[1]。除了作為役畜外，水牛還可提供奶類和肉類，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-9]。水牛奶乳汁濃厚，奶質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的乳脂肪(8.0%)、乳蛋白(4.5%)、不飽和脂肪酸比例和較低的磷脂和膽固醇水平[10]，有“奶中之王”之稱。然而，水牛平均產(chǎn)奶量遠(yuǎn)低于荷斯坦奶牛，奶產(chǎn)量?jī)H占世界牛奶產(chǎn)量的13%[11]。因此，提高水牛泌乳性能至關(guān)重要，而挖掘與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的候選基因則有助于改善水牛泌乳性能。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activators of transcription,STATs)家族，存在于細(xì)胞質(zhì)中并被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等胞外信號(hào)刺激磷酸化后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)，并作用于細(xì)胞核內(nèi)特異的DNA片段，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，并參與腫瘤的發(fā)生和惡化[12]。STAT家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6共7個(gè)家族成員組成。其中，STAT1可通過參與生長(zhǎng)激素[13]與催乳素[14]的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響哺乳動(dòng)物的泌乳性能[15]。STAT2是對(duì)I型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子[16]，STAT2缺失可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和形成二維菌落的能力[17]。STAT3對(duì)正常的細(xì)胞的一些生理功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，例如細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等相關(guān)的一系列基因異常的高表達(dá)由STAT3的持續(xù)激活完成[18]。STAT4表達(dá)于髓樣組織中，特別是睪丸組織和乳腺組織[19-20]，在動(dòng)物生殖系統(tǒng)和泌乳系統(tǒng)中通過結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)的STAT4順式作用元件調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮一定作用。STAT5對(duì)髓系細(xì)胞的發(fā)育具有重要意義，而且還通過與T細(xì)胞中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)不同的機(jī)制來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[21]。STAT5基因敲除可抑制水牛乳腺上皮細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)化，顯著降低乳蛋白基因的表達(dá)，而STAT5基因過表達(dá)可顯著提高乳蛋白基因的表達(dá)[22]。STAT6在各種腫瘤中表達(dá)強(qiáng)烈，與癌細(xì)胞增殖、惡性程度增加有關(guān)，在人類惡性淋巴瘤、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌中表達(dá)最高[23]。大量研究表明，STATs對(duì)哺乳動(dòng)物的乳房疾病、泌乳性能等方面起重要作用[24]。然而目前關(guān)于水牛STAT基因家族的研究較少，本研究以水牛基因組為參考，從全基因組水平鑒定水牛的STAT家族成員，分析該家族成員的蛋白序列特征、motif分布、外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、染色體定位、共線性關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)量差異，為后續(xù)更深入挖掘水牛STAT基因家族的功能提供了理論基礎(chǔ)。

1 方 法

1.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)下載

研究以水牛及其相關(guān)物種的全基因組序列和水牛乳腺組織RNA-seq數(shù)據(jù)(Accession：PRJNA480718)為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。全基因組數(shù)據(jù)包括全基因組的基因序列、蛋白質(zhì)序列和基因注釋文件。全基因組數(shù)據(jù)下載地址為：

水牛，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=buffalo；

奶牛，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=cow；

牦牛，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Bos+mutus；

山羊，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=goat；

綿羊，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Ovis+aries；

馬，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Equus+caballus；

駱駝，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Camelus+ferus。

RNA-seq數(shù)據(jù)下載于NCBI(Accession：PRJNA480718)，包括SRR7523531～SRR7523538.sra共8個(gè)文件。

1.2 水牛STAT基因家族成員蛋白序列的獲得

登陸UniProt(https://www.uniprot.org/)搜索STAT基因家族的蛋白質(zhì)序列，勾選所有該家族不同物種的可靠蛋白序列，下載保存并使用MEGA7.0軟件比對(duì)其同源性。登陸NCBI下載水牛完整蛋白序列，再使用hmmbuild和hmmsearch軟件構(gòu)建HMM模型并搜索序列庫(kù)找到水牛STAT基因家族所有的蛋白序列，最后使用TBtools軟件將序列提取出來。

1.3 水牛STATs蛋白序列特征分析

使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)計(jì)算水牛STAT家族蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)；使用TBtools軟件中的Table Row Extract or Filter插件從水牛和奶牛的基因注釋文件中提取STATs染色體分布信息。

1.4 水牛STATs motif分析及基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)和GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析水牛STAT家族蛋白質(zhì)保守motif和基因結(jié)構(gòu)；使用Pfam(http://pfam.xfam.org/)搜索每個(gè)motif所屬的結(jié)構(gòu)域；使用MEGA7.0構(gòu)建水牛STAT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹；最后使用TBtools軟件將水牛STATs系統(tǒng)進(jìn)化樹和motif分析結(jié)果整合到一起進(jìn)行可視化。

1.5 水牛和奶牛STATs共線性分析

為了探討STAT家族的進(jìn)化進(jìn)展，本研究使用one step MCscanX插件對(duì)水牛和奶牛的種內(nèi)及種間進(jìn)行共線性分析，使用Advanced Circos插件繪制相應(yīng)的關(guān)系圖。使用SimpleKa/KsCalculator(NG)插件計(jì)算水牛串聯(lián)重復(fù)STAT基因的Ka/Ks(進(jìn)化選擇壓力)。

1.6 不同物種STATs系統(tǒng)發(fā)育分析

為揭示水牛與其近緣物種STATs之間的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA7.0構(gòu)建水牛、奶牛、牦牛、山羊、綿羊、馬和駱駝的STAT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，最后使用Adobe Illustrator CS6對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹圖片進(jìn)行美化。

1.7 水牛STATs表達(dá)分析

為揭示STATs不同成員在水牛乳腺組織中的表達(dá)量差異，本試驗(yàn)選用8個(gè)不同水牛乳腺組織RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行STATs表達(dá)量分析。使用sratoolkit將所有RNA-seq原始sra文件轉(zhuǎn)換為fastq格式。運(yùn)用kallisto構(gòu)建水牛STAT基因家族index庫(kù)，并分別比對(duì)8個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)，進(jìn)行量化分析，計(jì)算STATs在不同RNA-seq中的TPM(transcripts per million)值，由TPM值來表示基因的表達(dá)量。最后使用TBtools軟件中的Heatmap插件對(duì)其進(jìn)行可視化，繪制STATs在不同水牛乳腺組織中的表達(dá)量熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 水牛STAT蛋白序列的獲得及特征分析

對(duì)水?；蚪M的蛋白序列進(jìn)行搜索，最終共鑒定得到7條水牛STAT蛋白的編碼基因，命名為bbu.STAT1～6，其中bbu.STAT5分為bbu.STAT5A和bbu.STAT5B。染色體分布情況結(jié)果顯示：bbu.STAT1和bbu.STAT4位于2號(hào)染色體，bbu.STAT2和bbu.STAT6位于4號(hào)染色體，bbu.STAT3、bbu.STAT5A和bbu.STAT5B位于3號(hào)染色體。bbu.STAT2的蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為865 aa，最短的是bbu.STAT4，為748 aa。所有蛋白的等電點(diǎn)介于4.9～6.6之間，均小于7(表1)。

表1 水牛STAT蛋白序列特征

2.2 水牛STATs motif分析和基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)水牛STATs系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，可將水牛STAT家族基因分為3組，即STAT1、STAT3、STAT4為一組，STAT2單獨(dú)為一組，STAT5A、STAT5B和STAT6為一組。

蛋白保守基序結(jié)果顯示：共預(yù)測(cè)出10個(gè)保守的motifs(命名為Motif 1～10)。這10個(gè)保守motifs的分布見圖1，詳細(xì)的氨基酸序列信息見表2。在Pfam搜索過后，由圖1可知，水牛STAT家族成員中，除了STAT2外，均含有預(yù)測(cè)出的Motif 1～10且排序相同，而STAT2缺少了Motif10。

表2 水牛中10個(gè)不同的motif

基因結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示：水牛STAT1和STAT4基因有25個(gè)外顯子，24個(gè)內(nèi)含子，STAT2和STAT3有24個(gè)外顯子，23個(gè)內(nèi)含子，STAT5A和STAT5B有19個(gè)外顯子，18個(gè)內(nèi)含子，STAT6有22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子(圖1)。

2.3 水牛和奶牛STATs共線性分析

為了研究STAT家族的進(jìn)化進(jìn)展，對(duì)水牛和奶牛的種內(nèi)及種間進(jìn)行共線性分析。結(jié)果表明，在水牛中，有3對(duì)基因：位于2號(hào)染色體的STAT1-STAT4、位于3號(hào)染色體STAT3-STAT5A和STAT5A-STAT5B表現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)。在奶牛中也發(fā)現(xiàn)了3對(duì)基因：位于2號(hào)染色體的STAT1-STAT4、位于19號(hào)染色體的STAT5A-STAT3和STAT5B-STAT5A表現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)(圖2A和B)。種間共線性分析結(jié)果表明：水牛STAT與奶牛STAT存在4對(duì)片段重復(fù)基因，分別是bbu.STAT1-bta.STAT1、bbu.STAT2-bta.STAT2、bbu.STAT3-bta.STAT5B和bbu.STAT6-bta.STAT6(圖2C)。

計(jì)算水牛STATs串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks(進(jìn)化選擇壓力)結(jié)果顯示：水牛3對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因中，STAT1-STAT4的非同義替換(Ka)/同義替換(Ks)值為NaN，STAT3-STAT5A和STAT5A-STAT5B的值均小于0.5(表3)。

表3 水牛STAT家族串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks

2.4 不同物種STATs系統(tǒng)發(fā)育分析

為揭示水牛與水牛近緣物種STATs之間的進(jìn)化關(guān)系，分別獲取了奶牛(Bostaurus)、牦牛(Bosmutus)、山羊(Caprahircas)、綿羊(Ovisaries)、馬(Equuscaballus)和駱駝(Camelusferus)的STAT家族蛋白序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。根據(jù)進(jìn)化樹信息，發(fā)現(xiàn)所有的基因劃分為4大類，分別是GroupA、GroupB、GroupC和GroupD，GroupA包括所有上述物種的STAT1、STAT3和STAT4，GroupB包括STAT2，GroupC包括STAT6，GroupD包括STAT5A和STAT5B。其中水牛STAT家族基因與奶牛和牦牛的聚類更為相近。

2.5 水牛STAT基因家族表達(dá)分析

為了探索STATs對(duì)水牛乳房發(fā)育及泌乳性能的作用，本試驗(yàn)利用8個(gè)水牛乳腺組織RNA-seq數(shù)據(jù)，分析了7個(gè)水牛STAT基因的表達(dá)量。根據(jù)TPM計(jì)算結(jié)果顯示，這7個(gè)STAT基因在乳腺組織中均有表達(dá)，其中STAT5A的表達(dá)量最高，STAT4的表達(dá)量最低(表4、圖4)。

表4 STAT家族在8頭水牛乳腺組織轉(zhuǎn)錄組中的TPM值

3 討 論

STATs是細(xì)胞因子相關(guān)信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)，在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和存活上起重要作用[18]，是細(xì)胞表面和細(xì)胞核之間的紐帶[12]。目前，我們對(duì)于水牛STAT家族了解較少。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)在水牛全基因組序列中鑒定出7個(gè)STAT家族成員，根據(jù)它們的進(jìn)化關(guān)系分成了3組。這7個(gè)STAT基因蛋白長(zhǎng)度在748～865 aa之間，等電點(diǎn)PI均小于7，這說明水牛STAT蛋白均屬于酸性蛋白質(zhì)。基因結(jié)構(gòu)分析看出不同的組具有不同的內(nèi)含子數(shù)模式。Motif分析顯示，水牛STAT基因家族成員中，除了STAT2外，其余成員的蛋白中都包括了STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind和SH2這4個(gè)結(jié)構(gòu)域且motif排序相同，表明水牛STAT基因家族成員蛋白功能相似。

在遺傳進(jìn)化過程中，串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制有助于加速基因家族的擴(kuò)增和基因組進(jìn)化機(jī)制，為獲取新的基因功能提供了可能[22]。本次對(duì)水牛和奶牛的種內(nèi)共線性分析中，均發(fā)現(xiàn)3對(duì)相同成員的STAT基因表現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)且沒有發(fā)現(xiàn)片段重復(fù)。由此可以推測(cè)串聯(lián)復(fù)制在水牛和奶牛STAT家族的擴(kuò)增中起著主導(dǎo)作用。此外，水牛和奶牛種間共線性關(guān)系很高并且發(fā)現(xiàn)了4對(duì)片段重復(fù)STAT基因，說明兩者親緣關(guān)系非常接近[23]。基因在復(fù)制的過程中產(chǎn)生遺傳變異，導(dǎo)致功能分歧，隨后純化選擇將功能固定下來[28]。因此本研究對(duì)于水牛串聯(lián)重復(fù)的STAT基因?qū)M(jìn)行了Ka/Ks計(jì)算，結(jié)果顯示有2對(duì)Ka/Ks值小于0.5，其中STAT5A-STAT5B小于0.1，說明該基因?qū)哂懈鼜?qiáng)的純化選擇壓力，功能更穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響。

不同物種STAT系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，不同物種的直系同源STAT基因聚類在一起，可以看出STAT基因家族具有較高的保守性，其中水牛與奶牛和牦牛的聚類更為接近。在進(jìn)化中的這種高度保守，也暗示了其在哺乳動(dòng)物中具有重要的生物學(xué)功能。

在RNA-seq中，每個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平由映射片段的總數(shù)來測(cè)量，這與其豐度水平成正比。TPM(transcripts per million)則是表現(xiàn)RNA豐度的一個(gè)單位[29]。本研究基于水牛乳腺組織RNA-seq的STATs表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，所有STAT基因在乳腺組織中均有表達(dá)，STAT3、STAT5A、STAT5B和STAT6的表達(dá)量較高，其中STAT5A的表達(dá)量最高。有研究表明，STAT3可通過調(diào)節(jié)乳脂小球的攝取和溶酶體膜通透性控制乳腺細(xì)胞死亡[30]。STAT6基因敲除可抑制人乳腺癌細(xì)胞系的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。STAT5A對(duì)于乳房發(fā)育[32]、免疫[33]、脂質(zhì)沉積和脂肪細(xì)胞新陳代謝[34]都有重要作用[14]。敲除STAT5A的小鼠在孕期因上皮細(xì)胞減少和分化障礙而不能形成具有正常功能的乳腺組織[35]。在水牛中，STAT5表達(dá)與乳腺細(xì)胞增殖和乳蛋白合成密切相關(guān)。與非泌乳期相比，泌乳期STAT5A和STAT5B表達(dá)顯著降低且STAT5A在乳腺的表達(dá)量最高[32]。由此可以推測(cè)水牛STAT基因家族參與調(diào)控乳房發(fā)育及泌乳過程，其中STAT5A可能起更重要的作用。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)水牛STAT基因家族進(jìn)行分析，對(duì)未來研究該基因家族在水牛泌乳、乳房疾病等相關(guān)生產(chǎn)方面的功能和提高水牛奶品質(zhì)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，水牛STAT基因家族包括STAT1～4、STAT5A、STAT5B和STAT6共7個(gè)成員，預(yù)測(cè)出10個(gè)motif保守結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)3對(duì)水牛STAT基因?qū)Ρ憩F(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)，其中2對(duì)受純化選擇。聚類分析表明水牛STAT基因家族與奶牛和牦牛的聚類更為接近。在水牛乳腺組織中，STAT5A的表達(dá)量最高，STAT4的表達(dá)量最低。推測(cè)水牛STAT基因家族參與調(diào)控乳房發(fā)育及泌乳過程，其中STAT5A可能起更重要的作用。