胡秋芳 張 娟 盛天昕 楊小東 陳司漢

1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護系，四川樂山 614000；2.四川省德陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川德陽 618000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川成都 614000

肺泡微結(jié)石癥是（pulmonary alveolar microlithiasis，PAM）以兩肺肺泡內(nèi)鈣、磷微小結(jié)石沉積及繼發(fā)肺間質(zhì)纖維化改變?yōu)樘卣鞯囊环N罕見肺部疾病。該病有家族遺傳傾向，多以常染色體隱性方式遺傳，其發(fā)病與SLC34A2（solute carrier family 34 member 2）基因突變有關(guān)[1]。該基因編碼Na 依賴的Pi 轉(zhuǎn)運蛋白NaPi-Ⅱb，該蛋白主要表達于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，主要作用是從肺泡液中吸收無機磷用于肺泡表面活性物質(zhì)的合成。SLC34A2 基因突變后使NaPi-Ⅱb 蛋白質(zhì)形成異常，導(dǎo)致肺泡內(nèi)鈣磷轉(zhuǎn)運失調(diào)，無機磷積累，進而引發(fā)磷酸鈣鹽沉積[2-3]。隨著近年來對該病認(rèn)識的增加，至今為止已有30 種不同的SLC34A2 基因變異被報道[3]。我國報道的SLC34A2 基因突變多為外顯子8 突變[4]。現(xiàn)報道1例PAM 患者的SLC34A2 基因突變特點。

1 病例資料

1.1 一般資料

患者男，30 歲，自幼常因“感冒”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，行胸片檢查考慮“肺結(jié)核”，未進一步檢查及規(guī)律抗結(jié)核治療，一般予以輸液治療幾天后癥狀緩解。3年前患者反復(fù)出現(xiàn)咳嗽、咳痰，活動及感冒后感氣緊，行胸部CT 檢查提示雙肺彌漫顆粒狀結(jié)節(jié)影，余無特殊?；颊吒改笩o近親關(guān)系，家系中父親所有弟弟均未婚，父親妹妹與母親弟弟結(jié)婚，第三代包括先證者共4 人（家系圖譜見圖1）。其他家系成員無類似癥狀。

圖1 病例家系系譜圖

1.2 體格檢查

查體：體重62 kg，身高168 cm，唇無發(fā)紺，無杵狀指，心界正常，心律齊，各瓣膜區(qū)未聞及雜音。雙肺呼吸音稍低，未聞及干濕啰音，雙下肢無水腫。

1.3 輔助檢查

血鈣：2.07 mmol/L，肺功能：①FVC 為4.01 L（與預(yù)計值之比為87.9%）；②FEV1為13.76 L（預(yù)計值之比為97.4%）；③FEV1/FVC 為94%；④BR 輕度降低，DLCO 中度下降，VEDA＞10 L；⑤患者彌散功能中度降低，通氣儲備功能輕度下降，過度通氣，肺功能中度受損。胸部CT 檢查提示：雙肺彌漫高密度結(jié)節(jié)影，以中下肺為主，呈“暴風(fēng)雪”或“沙暴”樣改變，提示肺泡微結(jié)石癥；雙肺間質(zhì)改變，雙肺胸膜增厚、粘連、鈣化；縱膈淋巴結(jié)增大（圖2）。在排除粟粒型肺結(jié)核、塵肺、肺含鐵血黃素沉著癥等疾病，根據(jù)患者病史、典型臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果，擬診為PAM。

圖2 患者胸部CT 肺窗及縱膈窗

1.4 基因檢測資料

經(jīng)知情同意后，患者及在世家族4 名成員均用乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管抽取外周靜脈血4 ml，DNA 提取采用基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。DNA抽提后用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測純度及含量。對SLC34A2 基因13 個外顯子中的12 個外顯子設(shè)計引物進行PCR 擴增，將PCR 擴增產(chǎn)物送至上海生工生物公司進行測序分析。首先檢測患者12 個外顯子的編碼區(qū)和剪接位點的突變，確定可能的突變位點，然后針對突變位點再檢測突變在其家族成員中的分布情況。另取100 例無關(guān)正常人外周血DNA 作為對照。

1.4.1 PCR 擴增結(jié)果 SLC34A2 基因2-13 號外顯子成功擴增（圖3）。

圖3 SLC34A2 基因2-13 號外顯子擴增產(chǎn)物

1.4.2 基因檢測結(jié)果 該PAM 家系成員基因經(jīng)雙向測序發(fā)現(xiàn)，患者SLC34A2 基因突變?yōu)橥怙@子8 突變c.910A＞T（p.K304X）（圖4）；SNP 位點有2 個突變即內(nèi)含子12 的rs199563183 (p.Y455H)（圖5）和外顯子13 的rs3733545（圖6）同時出現(xiàn)突變。其父親外顯子8 c.910A＞T（p.K304X）存在突變，母親SNP 位點也有以上2 個突變。家系中患者舅舅無突變位點。

圖4 外顯子8 突變位點測序圖

圖5 內(nèi)含子12∶rs 199563183 突變位點測序圖

圖6 外顯子13∶rs3733545 突變位點測序圖

2 討論

PAM 是一種罕見的以磷酸鈣鹽顆粒在雙肺肺泡內(nèi)沉積為特征的疾病，由SLC34A2 基因變異引起。于1868年最早由Marcello 報道描述，之后全世界各大洲均有陸續(xù)報道，目前報道的病例數(shù)不到1100 例[5-6]，其中以土耳其和歐洲多見。PAM 患者早期癥狀不明顯，多在30～40 歲逐漸出現(xiàn)干咳、呼吸困難、咯血、氣胸及肺心病等癥狀。臨床上主要結(jié)合X 線、胸部CT及肺活檢對PAM 進行確診，患者雙肺可見彌漫性砂粒樣鈣化結(jié)節(jié)影，且隨病情進展鈣化灶逐漸增多并出現(xiàn)聚集融合，呈現(xiàn)“暴風(fēng)雪”改變。近年來很多研究證實PAM 具有家族遺傳傾向是一種常染色體隱性遺傳病，其家族史報道頻率為32%～61%[2，7]。遺傳病例報道中不存在性別傾向，但散發(fā)病例以男性為主（57.7%）[7-8]。

PAM 發(fā)病與SLC34A2 基因突變有關(guān)，該基因?qū)儆谌苜|(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族SLC34 的成員之一，位于染色體4p15.31-p15.2，全長21033bp，包括13 個外顯子[9-10]，除第1 個外顯子是非編碼，其余12 個均為編碼外顯子。SLC34A2 在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞高表達，其編碼的轉(zhuǎn)運蛋白NaPi-Ⅱb 含有690 個氨基酸的多次跨膜蛋白，至少有8 個跨膜α 螺旋區(qū)組成，研究推測胞質(zhì)內(nèi)側(cè)和外側(cè)各有一短環(huán)具有轉(zhuǎn)運通路的重要功能區(qū)域[11]，其主要作用是從肺泡液中吸收無機磷用于肺泡表面活性物質(zhì)的合成。當(dāng)SLC34A2 基因突變后會導(dǎo)致該轉(zhuǎn)運蛋白形成異常，從而使肺泡內(nèi)鈣磷轉(zhuǎn)運失調(diào)，磷酸鹽堆積無法清除，從而為微結(jié)石的形成提供條件。Saito 等[12]通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞缺少NaPi-Ⅱb 可導(dǎo)致肺泡內(nèi)微結(jié)石形成及進行性限制性肺疾病的發(fā)生。

目前有許多關(guān)于SLC34A2 基因突變的文獻報道，其突變位點有外顯子1、2、3、4、6、7、8、11、12 和13，且分布具有種族或地域傾向[13]。如土耳其病例報道中除外顯子7 和8 未發(fā)現(xiàn)突變，其他的外顯子均有突變，日本病例中主要是外顯子7 或8 突變，而在中國的病例報道中多在外顯子8 出現(xiàn)突變，僅有1例突變在外顯子6[14-15]。本病例也呈外顯子8 突變，但與以往報道不同的是該患者SNP 出現(xiàn)新的兩個突變位點即內(nèi)含子12、外顯子13。其中外顯子8 的突變位點c.910A＞T 來源于父系，即cDNA 的第910 號密碼子由A→T,從而使氨基酸AAA（賴氨酸）→TAA，提前出現(xiàn)終止密碼子，以致不能產(chǎn)生正常功能蛋白從而導(dǎo)致肺泡微結(jié)石的形成?；驒z測發(fā)現(xiàn)新突變的位點內(nèi)含子12 及外顯子13 的3′-UTR 區(qū)來源于母系，該位點的突變類型尚未報道過。進一步分析發(fā)現(xiàn)rs3733545 位于13 號外顯子3′-UTR 區(qū),等位基因二元狀態(tài)為G/T，G 為祖先型等位基因，本例患者的等位基因G 來自母親，T 來自父親。由于該SNP 位點的兩種等位基因頻率相近，因此推測其致病的可能性較小。而rs199563183位于12 號內(nèi)含子第26 位堿基,等位基因二元狀態(tài)為G/A，G 為祖先型等位基因，等位基因A 存在極低的群體頻率，有潛在致病的可能，患者該位點的等位基因A 來自母親，與c.910A＞T 來源于不同的單體型，存在致病的可能性。通過家系基因分析看出，父親有外顯子8 的突變，母親有內(nèi)含子12 的突變，但父親與母親均未發(fā)病，而患者完全符合PAM 的特點，由此可見p.K304X 和p.Y455H 的突變可能共同引起了蛋白功能的改變，導(dǎo)致患者自幼發(fā)病，病情呈進行性發(fā)展的特點。

3 結(jié)論

PAM 是一種罕見的肺部疾病，以磷酸鈣鹽顆粒在雙肺肺泡內(nèi)沉積為特征，有家族遺傳傾向，多呈常染色體隱性遺傳方式發(fā)病。其中SLC34A2 在PAM 的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，對SLC34A2 基因的研究可能成為PAM 精準(zhǔn)基因診治的突破點，其是否存在復(fù)合雜合突變致病的可能有待進一步探索。中國PAM 患者突變位點更傾向于外顯子8，而外顯子8 的c.910A＞T 突變可能用于中國可疑PAM 患者的臨床基因篩查或治療靶點。