張海超， 高美華， 劉蓓蕾， 王 敬， 艾連峰*， 霍惠玲， 李研東

(1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北石家莊 050051；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北石家莊 050035)

巴比妥類(lèi)藥物是一類(lèi)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安眠鎮(zhèn)靜劑[1]，常見(jiàn)的有巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥。該類(lèi)藥物在畜牧養(yǎng)殖中具有減少動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)、降低運(yùn)動(dòng)消耗和增重催肥的作用[2]，但具有很強(qiáng)的毒副作用，易產(chǎn)生依賴(lài)性，可引起蓄積性中毒。人長(zhǎng)期服用含有巴比妥類(lèi)藥物的動(dòng)物源性食品會(huì)使肝臟負(fù)擔(dān)加重，頭腦昏沉，引起記憶受損，同時(shí)還會(huì)使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和肌肉功能受到抑制。我國(guó)農(nóng)業(yè)部早于2002年就發(fā)布176號(hào)公告，嚴(yán)禁巴比妥、異戊巴比妥和苯巴比妥用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，但受利益驅(qū)使將這些藥物非法添加到獸藥制劑中的事件時(shí)有發(fā)生，養(yǎng)殖戶(hù)在不知情的情況下使用，不僅誘導(dǎo)畜禽產(chǎn)生耐藥性，而且導(dǎo)致藥物在動(dòng)物源性食品中殘留，給人們帶來(lái)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。目前針對(duì)獸藥制劑中非法添加的巴比妥類(lèi)藥物的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，為規(guī)范獸藥市場(chǎng)秩序，保證用藥質(zhì)量安全，建立獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)技術(shù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

當(dāng)前關(guān)于巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)基質(zhì)主要是動(dòng)物源性食品[3 - 6]、飼料[2,7,8]、保健食品[9]及生物樣本[10 - 14]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的普遍使用，氣相色譜-質(zhì)譜法[3 - 6,10,12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2,5,7-9,11,13,14]已成為該類(lèi)藥物的主要檢測(cè)手段。氣相色譜-質(zhì)譜法往往需要衍生化，其操作較為繁瑣。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，適用于獸藥基質(zhì)中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定。本研究采用乙腈提取獸藥制劑中巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥和異戊巴比妥4種藥物成分，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，測(cè)定了獸藥制劑中非法添加的4種巴比妥類(lèi)藥物。該方法凈化效果好，普適性強(qiáng)，為獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定提供了新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本，Shimadzu公司)；3K-15離心機(jī)(美國(guó)，Sigma公司)；PT2100型均質(zhì)器(瑞士，Kinematica公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國(guó)，Biotage公司)；Milli-Q純水機(jī)(美國(guó)，Millipore公司)；HLB固相萃取柱(200 mg/6mL，美國(guó)Waters公司)。

巴比妥(CAS號(hào)：57-44-3)、苯巴比妥(CAS號(hào)：50-06-6)、異戊巴比妥(CAS號(hào)：57-43-2)和司可巴比妥CAS號(hào)：76-73-3)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于97%。乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸、乙酸、NH4Ac(優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Fluka公司)；NaCl(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃下避光保存，有效期為6個(gè)月。根據(jù)需要，準(zhǔn)確移取適量巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇-水(1∶1，V/V)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待用。

1.3 樣品預(yù)處理

粉劑樣品：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品(精確到0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，于均質(zhì)器上12 000 r/min均質(zhì)1 min。針劑和合劑樣品：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品(精確到0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈和4 g NaCl，于均質(zhì)器上12 000 r/min均質(zhì)1 min。將各樣品提取液以8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于另一50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混合，離心，取下層乙腈在45 ℃下氮?dú)獯抵两?。? mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1，V/V)充分溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

將HLB固相萃取柱置于固相萃取裝置中，先后用5 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)預(yù)淋洗，將上述提取液過(guò)柱，控制流速為0.5 mL/min。用5 mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1，V/V)淋洗，抽干。隨后用5 mL正己烷和5 mL正己烷-乙酸乙酯(95∶5，V/V)淋洗，最后用8 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)洗脫。將洗脫液在45 ℃下用氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇-水(1∶1，V/V)溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，供UPLC-MS/MS測(cè)試。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：水(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～1 min，10%B；1～5 min，10%～90%B；5～6 min，90%B；6～6.01 min，90%～10%B；6.01～8 min，10%B。流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子(ESI-)模式掃描；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。離子源溫度：400 ℃；毛細(xì)管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：350 ℃；氮?dú)饬魉伲?.0 L/min；干燥氣流速：10.0 L/min；加熱氣流速：10.0 L/min。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4種巴比妥藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 獸藥制劑抽樣種類(lèi)的選擇

安痛定注射液具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用，可用于動(dòng)物的解熱鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕，治療肌肉痛、關(guān)節(jié)痛和神經(jīng)痛等；白頭翁散具有鎮(zhèn)痛、抗痙攣等功效，可用于治療濕熱泄瀉、下痢膿血等；楊樹(shù)花口服液具有清熱解毒、化濕止痢、健脾養(yǎng)胃的功效，還可緩解畜禽在疾病期間的應(yīng)激反應(yīng)。巴比妥類(lèi)藥物鎮(zhèn)靜效果好、價(jià)格低廉，在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到具有類(lèi)似功能主治的獸藥制劑中。故選擇以上3種類(lèi)型獸藥制劑(針劑、粉劑、合劑)作為代表，建立獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定方法。

2.2 前處理方式的優(yōu)化

巴比妥類(lèi)藥物為取代的丙二酰脲類(lèi)化合物。分子中的內(nèi)酰亞胺結(jié)構(gòu)能夠互變?yōu)橄┐际蕉嗜跛嵝?，pKa為7.4，文獻(xiàn)報(bào)道該類(lèi)藥物常用的提取溶劑有乙腈、酸性乙腈和三氯甲烷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了這3種溶劑的提取效果。實(shí)驗(yàn)表明，3種提取溶劑對(duì)巴比妥類(lèi)藥物的提取率無(wú)明顯差異，但三氯甲烷提取溶液顏色較深，因此從實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便性和提取更少雜質(zhì)考慮，本方法采用乙腈提取，氮吹干后，以磷酸鹽緩沖溶液(pH=5)-甲醇混合溶液溶解上樣。獸藥制劑基質(zhì)含有大量油脂，在磷酸鹽緩沖液中加入適量甲醇溶解可保證化合物溶解充分。上樣液選用pH值為5的磷酸鹽緩沖溶液可保證目標(biāo)物呈中性狀態(tài)。

本文首先參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23741-2009)中的凈化方式，采用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，用磷酸緩沖溶液和甲醇水溶液淋洗，二氯甲烷洗脫，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾嚴(yán)重，影響了化合物的的響應(yīng)值，巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥采用此種凈化方式后的MRM色譜圖見(jiàn)圖1a。為消除基質(zhì)干擾獲得較高回收率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)凈化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，首先對(duì)提取液用正己烷進(jìn)行了液液萃取，然后在固相萃取過(guò)程中利用極性相互作用，用正己烷進(jìn)行淋洗，去除了大量非極性雜質(zhì)干擾。最后用正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，避免了同時(shí)洗脫出大量極性雜質(zhì)，巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥經(jīng)優(yōu)化凈化流程后的MRM色譜圖見(jiàn)圖1b。由此圖可見(jiàn)，經(jīng)優(yōu)化后本實(shí)驗(yàn)的凈化效果顯著。

圖1 4種巴比妥類(lèi)藥物在兩種凈化方式下MRM色譜圖(a:優(yōu)化前；b;優(yōu)化后)

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

方法采用MRM模式對(duì)待測(cè)物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。將4種巴比妥類(lèi)藥物分別在正、負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示4種化合物均在負(fù)離子模式下質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng)，因此選擇準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-作為母離子。然后在負(fù)離子模式下對(duì)[M-H]-峰進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)值最大的碎片離子為定量離子，次級(jí)響應(yīng)最大的碎片離子為定性離子，然后自動(dòng)優(yōu)化碰撞能量、Q1和Q3電壓等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成和添加劑對(duì)分析物的峰形、基質(zhì)效應(yīng)和離子化效率均會(huì)造成一定的影響。本文在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，考察了不同流動(dòng)相組成對(duì)于分析物靈敏度的影響。首先選取了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液和甲醇-水溶液三組流動(dòng)相組成，考察了對(duì)50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液靈敏度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2a。由此圖可以看出，在流動(dòng)相中加入一定比例的甲酸會(huì)對(duì)化合物靈敏度產(chǎn)生抑制作用，甲醇和乙腈對(duì)4種化合物靈敏度影響差異不大。隨后本實(shí)驗(yàn)把三組流動(dòng)相組成對(duì)50 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液靈敏度的影響做了比較。由圖2b可見(jiàn)，在基質(zhì)的影響下各化合物的靈敏度均受到抑制，但甲醇比乙腈對(duì)4種化合物的抑制效應(yīng)更強(qiáng)。因此，最終選擇乙腈-水溶液作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相，4種化合物靈敏度最高。

圖2 流動(dòng)相對(duì)4種巴比妥類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)靈敏度的影響

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

本研究通過(guò)優(yōu)化凈化方式和流動(dòng)相組成消弱了部分基質(zhì)效應(yīng)的干擾，但獸藥制劑基質(zhì)較為復(fù)雜，目標(biāo)物在基質(zhì)中依然存在一定的的基質(zhì)抑制現(xiàn)象。取空白基質(zhì)溶液和溶劑分別配制50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)效應(yīng)在31%～82%之間。為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采用空白樣品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，從而降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用空白基質(zhì)溶液配制20、50、100、200、500、1 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)，分析物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。4種巴比妥類(lèi)藥物在20～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9980。在空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比(S/N)≥3時(shí)的含量為方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10時(shí)的含量為方法的定量限(LOQ)，LOD和LOQ分別為20 μg/kg、50 μg/kg。

表2 不同基質(zhì)中4種巴比妥類(lèi)藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)r

(續(xù)表2)

2.6 方法的回收率和精密度

選取了安痛定注射液、白頭翁散、楊樹(shù)花口服液空白樣品，分別添加50、100和500 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度，按本方法進(jìn)行處理和測(cè)定，進(jìn)行加入回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平測(cè)定6次，其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表3。由表3可知，方法的回收率在70.5%～96.4%之間，RSD在3.3%～10.4%之間。

表3 方法的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

2.7 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)送檢的15份獸藥制劑樣品進(jìn)行了測(cè)定，均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用HLB固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，開(kāi)發(fā)了獸藥制劑中4種巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)方法。本方法采用乙腈提取，HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，通過(guò)對(duì)固相萃取過(guò)程優(yōu)化，降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響，方法操作簡(jiǎn)單、普適性強(qiáng)。該方法的建立為分析獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物提供了新的技術(shù)手段。