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        固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物

        2022-04-13 14:23:54張海超高美華劉蓓蕾艾連峰霍惠玲李研東
        分析科學(xué)學(xué)報(bào) 2022年1期
        關(guān)鍵詞:正己烷獸藥類(lèi)藥物

        張海超, 高美華, 劉蓓蕾, 王 敬, 艾連峰*, 霍惠玲, 李研東

        (1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心,河北石家莊 050051;2.河北省獸藥監(jiān)察所,河北石家莊 050035)

        巴比妥類(lèi)藥物是一類(lèi)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安眠鎮(zhèn)靜劑[1],常見(jiàn)的有巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥。該類(lèi)藥物在畜牧養(yǎng)殖中具有減少動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)、降低運(yùn)動(dòng)消耗和增重催肥的作用[2],但具有很強(qiáng)的毒副作用,易產(chǎn)生依賴(lài)性,可引起蓄積性中毒。人長(zhǎng)期服用含有巴比妥類(lèi)藥物的動(dòng)物源性食品會(huì)使肝臟負(fù)擔(dān)加重,頭腦昏沉,引起記憶受損,同時(shí)還會(huì)使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和肌肉功能受到抑制。我國(guó)農(nóng)業(yè)部早于2002年就發(fā)布176號(hào)公告,嚴(yán)禁巴比妥、異戊巴比妥和苯巴比妥用于畜禽養(yǎng)殖業(yè),但受利益驅(qū)使將這些藥物非法添加到獸藥制劑中的事件時(shí)有發(fā)生,養(yǎng)殖戶(hù)在不知情的情況下使用,不僅誘導(dǎo)畜禽產(chǎn)生耐藥性,而且導(dǎo)致藥物在動(dòng)物源性食品中殘留,給人們帶來(lái)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。目前針對(duì)獸藥制劑中非法添加的巴比妥類(lèi)藥物的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此,為規(guī)范獸藥市場(chǎng)秩序,保證用藥質(zhì)量安全,建立獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)技術(shù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        當(dāng)前關(guān)于巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)基質(zhì)主要是動(dòng)物源性食品[3 - 6]、飼料[2,7,8]、保健食品[9]及生物樣本[10 - 14]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的普遍使用,氣相色譜-質(zhì)譜法[3 - 6,10,12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2,5,7-9,11,13,14]已成為該類(lèi)藥物的主要檢測(cè)手段。氣相色譜-質(zhì)譜法往往需要衍生化,其操作較為繁瑣。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng),適用于獸藥基質(zhì)中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定。本研究采用乙腈提取獸藥制劑中巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥和異戊巴比妥4種藥物成分,經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后,使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),測(cè)定了獸藥制劑中非法添加的4種巴比妥類(lèi)藥物。該方法凈化效果好,普適性強(qiáng),為獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定提供了新途徑。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本,Shimadzu公司);3K-15離心機(jī)(美國(guó),Sigma公司);PT2100型均質(zhì)器(瑞士,Kinematica公司);TurboVap LV氮吹儀(美國(guó),Biotage公司);Milli-Q純水機(jī)(美國(guó),Millipore公司);HLB固相萃取柱(200 mg/6mL,美國(guó)Waters公司)。

        巴比妥(CAS號(hào):57-44-3)、苯巴比妥(CAS號(hào):50-06-6)、異戊巴比妥(CAS號(hào):57-43-2)和司可巴比妥CAS號(hào):76-73-3)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,純度大于97%。乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);甲酸、乙酸、NH4Ac(優(yōu)級(jí)純,德國(guó)Fluka公司);NaCl(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

        1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        分別稱(chēng)取巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.01 mg),用甲醇溶解并定容至10 mL,配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃下避光保存,有效期為6個(gè)月。根據(jù)需要,準(zhǔn)確移取適量巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇-水(1∶1,V/V)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,待用。

        1.3 樣品預(yù)處理

        粉劑樣品:準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品(精確到0.01 g)于50 mL塑料離心管中,加入20 mL乙腈,于均質(zhì)器上12 000 r/min均質(zhì)1 min。針劑和合劑樣品:準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品(精確到0.01 g)于50 mL塑料離心管中,加入20 mL乙腈和4 g NaCl,于均質(zhì)器上12 000 r/min均質(zhì)1 min。將各樣品提取液以8 000 r/min離心5 min,取5 mL上清液于另一50 mL離心管中,加入10 mL乙腈飽和的正己烷,渦旋混合,離心,取下層乙腈在45 ℃下氮?dú)獯抵两?。? mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1,V/V)充分溶解殘?jiān)?,待凈化?/p>

        將HLB固相萃取柱置于固相萃取裝置中,先后用5 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)預(yù)淋洗,將上述提取液過(guò)柱,控制流速為0.5 mL/min。用5 mL 0.1 mol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1,V/V)淋洗,抽干。隨后用5 mL正己烷和5 mL正己烷-乙酸乙酯(95∶5,V/V)淋洗,最后用8 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1,V/V)洗脫。將洗脫液在45 ℃下用氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇-水(1∶1,V/V)溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后,供UPLC-MS/MS測(cè)試。

        1.4 儀器分析條件

        色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:水(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序:0~1 min,10%B;1~5 min,10%~90%B;5~6 min,90%B;6~6.01 min,90%~10%B;6.01~8 min,10%B。流速:0.4 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

        質(zhì)譜條件:電噴霧電離源,負(fù)離子(ESI-)模式掃描;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。離子源溫度:400 ℃;毛細(xì)管溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:350 ℃;氮?dú)饬魉伲?.0 L/min;干燥氣流速:10.0 L/min;加熱氣流速:10.0 L/min。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

        表1 4種巴比妥藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)

        2 結(jié)果與討論

        2.1 獸藥制劑抽樣種類(lèi)的選擇

        安痛定注射液具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用,可用于動(dòng)物的解熱鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕,治療肌肉痛、關(guān)節(jié)痛和神經(jīng)痛等;白頭翁散具有鎮(zhèn)痛、抗痙攣等功效,可用于治療濕熱泄瀉、下痢膿血等;楊樹(shù)花口服液具有清熱解毒、化濕止痢、健脾養(yǎng)胃的功效,還可緩解畜禽在疾病期間的應(yīng)激反應(yīng)。巴比妥類(lèi)藥物鎮(zhèn)靜效果好、價(jià)格低廉,在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到具有類(lèi)似功能主治的獸藥制劑中。故選擇以上3種類(lèi)型獸藥制劑(針劑、粉劑、合劑)作為代表,建立獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物的測(cè)定方法。

        2.2 前處理方式的優(yōu)化

        巴比妥類(lèi)藥物為取代的丙二酰脲類(lèi)化合物。分子中的內(nèi)酰亞胺結(jié)構(gòu)能夠互變?yōu)橄┐际蕉嗜跛嵝?,pKa為7.4,文獻(xiàn)報(bào)道該類(lèi)藥物常用的提取溶劑有乙腈、酸性乙腈和三氯甲烷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了這3種溶劑的提取效果。實(shí)驗(yàn)表明,3種提取溶劑對(duì)巴比妥類(lèi)藥物的提取率無(wú)明顯差異,但三氯甲烷提取溶液顏色較深,因此從實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便性和提取更少雜質(zhì)考慮,本方法采用乙腈提取,氮吹干后,以磷酸鹽緩沖溶液(pH=5)-甲醇混合溶液溶解上樣。獸藥制劑基質(zhì)含有大量油脂,在磷酸鹽緩沖液中加入適量甲醇溶解可保證化合物溶解充分。上樣液選用pH值為5的磷酸鹽緩沖溶液可保證目標(biāo)物呈中性狀態(tài)。

        本文首先參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23741-2009)中的凈化方式,采用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化,用磷酸緩沖溶液和甲醇水溶液淋洗,二氯甲烷洗脫,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾嚴(yán)重,影響了化合物的的響應(yīng)值,巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥采用此種凈化方式后的MRM色譜圖見(jiàn)圖1a。為消除基質(zhì)干擾獲得較高回收率,本實(shí)驗(yàn)對(duì)凈化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,首先對(duì)提取液用正己烷進(jìn)行了液液萃取,然后在固相萃取過(guò)程中利用極性相互作用,用正己烷進(jìn)行淋洗,去除了大量非極性雜質(zhì)干擾。最后用正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫,避免了同時(shí)洗脫出大量極性雜質(zhì),巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥經(jīng)優(yōu)化凈化流程后的MRM色譜圖見(jiàn)圖1b。由此圖可見(jiàn),經(jīng)優(yōu)化后本實(shí)驗(yàn)的凈化效果顯著。

        圖1 4種巴比妥類(lèi)藥物在兩種凈化方式下MRM色譜圖(a:優(yōu)化前;b;優(yōu)化后)

        2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        方法采用MRM模式對(duì)待測(cè)物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。將4種巴比妥類(lèi)藥物分別在正、負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示4種化合物均在負(fù)離子模式下質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng),因此選擇準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-作為母離子。然后在負(fù)離子模式下對(duì)[M-H]-峰進(jìn)行子離子掃描,選擇響應(yīng)值最大的碎片離子為定量離子,次級(jí)響應(yīng)最大的碎片離子為定性離子,然后自動(dòng)優(yōu)化碰撞能量、Q1和Q3電壓等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

        2.4 色譜條件的優(yōu)化

        流動(dòng)相的組成和添加劑對(duì)分析物的峰形、基質(zhì)效應(yīng)和離子化效率均會(huì)造成一定的影響。本文在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上,考察了不同流動(dòng)相組成對(duì)于分析物靈敏度的影響。首先選取了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液和甲醇-水溶液三組流動(dòng)相組成,考察了對(duì)50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液靈敏度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2a。由此圖可以看出,在流動(dòng)相中加入一定比例的甲酸會(huì)對(duì)化合物靈敏度產(chǎn)生抑制作用,甲醇和乙腈對(duì)4種化合物靈敏度影響差異不大。隨后本實(shí)驗(yàn)把三組流動(dòng)相組成對(duì)50 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液靈敏度的影響做了比較。由圖2b可見(jiàn),在基質(zhì)的影響下各化合物的靈敏度均受到抑制,但甲醇比乙腈對(duì)4種化合物的抑制效應(yīng)更強(qiáng)。因此,最終選擇乙腈-水溶液作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相,4種化合物靈敏度最高。

        圖2 流動(dòng)相對(duì)4種巴比妥類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)靈敏度的影響

        2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

        本研究通過(guò)優(yōu)化凈化方式和流動(dòng)相組成消弱了部分基質(zhì)效應(yīng)的干擾,但獸藥制劑基質(zhì)較為復(fù)雜,目標(biāo)物在基質(zhì)中依然存在一定的的基質(zhì)抑制現(xiàn)象。取空白基質(zhì)溶液和溶劑分別配制50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照本方法進(jìn)行測(cè)定,基質(zhì)效應(yīng)在31%~82%之間。為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)采用空白樣品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正,從而降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

        取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用空白基質(zhì)溶液配制20、50、100、200、500、1 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在優(yōu)化條件下測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/L),分析物峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。4種巴比妥類(lèi)藥物在20~1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9980。在空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以信噪比(S/N)≥3時(shí)的含量為方法的檢出限(LOD),以S/N≥10時(shí)的含量為方法的定量限(LOQ),LOD和LOQ分別為20 μg/kg、50 μg/kg。

        表2 不同基質(zhì)中4種巴比妥類(lèi)藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)r

        (續(xù)表2)

        2.6 方法的回收率和精密度

        選取了安痛定注射液、白頭翁散、楊樹(shù)花口服液空白樣品,分別添加50、100和500 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度,按本方法進(jìn)行處理和測(cè)定,進(jìn)行加入回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平測(cè)定6次,其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表3。由表3可知,方法的回收率在70.5%~96.4%之間,RSD在3.3%~10.4%之間。

        表3 方法的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

        2.7 實(shí)際樣品分析

        采用本方法對(duì)送檢的15份獸藥制劑樣品進(jìn)行了測(cè)定,均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

        3 結(jié)論

        本研究應(yīng)用HLB固相萃取柱凈化,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),開(kāi)發(fā)了獸藥制劑中4種巴比妥類(lèi)藥物的檢測(cè)方法。本方法采用乙腈提取,HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化,通過(guò)對(duì)固相萃取過(guò)程優(yōu)化,降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響,方法操作簡(jiǎn)單、普適性強(qiáng)。該方法的建立為分析獸藥制劑中巴比妥類(lèi)藥物提供了新的技術(shù)手段。

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