張 洋，劉進(jìn)輝，皇甫和平，李新鋒，李志強(qiáng)，閆躍飛，劉 歡，石冬梅

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心，河南 鄭州 450046)

黃曲霉毒素是由曲霉菌屬中的黃曲霉和寄生曲霉在高溫高濕環(huán)境下快速繁殖產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其污染的飼料種類很多，主要是花生餅、粕、干酒糟、棉籽粕和青貯飼料等[1,2]。在所有的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)危害最大，毒性最強(qiáng)，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍、三聚氰胺的416倍；致癌力為二甲基亞硝胺的70倍，六六六的1000倍，誘發(fā)肝癌的能力相當(dāng)于3，4-苯并芘的4000倍[3]。

AFB1污染日益受到人們的重視，2009—2011年從美洲、歐洲和亞洲采集的7049個家畜飼料樣品中，81%的樣品至少檢出一種霉菌毒素[4]；朱風(fēng)華等[5-7]于2014—2018年連續(xù)檢測了山東地區(qū)飼料原料和配料中AFB1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，發(fā)現(xiàn)上述毒素均有不同程度超標(biāo)；奶牛采食被霉菌毒素污染的飼料后容易引發(fā)多種疾病，有些霉菌毒素還會進(jìn)入牛奶中對人類健康造成威脅。查滿千等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AFB1對奶牛的消化系統(tǒng)、免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能均會造成不同程度的影響；張養(yǎng)軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AFB1對奶?？赡墚a(chǎn)生致畸、致癌和致突變的影響，不利于奶牛業(yè)的健康發(fā)展。因此定期開展對奶牛場飼料中霉菌毒素污染的檢測工作十分必要。

為了解近年來河南省奶牛場飼料中AFB1的污染情況，本研究對2019—2020年度河南省5個地區(qū)奶牛場的青貯飼料進(jìn)行AFB1檢測，以探索河南省全株玉米青貯飼料中AFB1的分布規(guī)律及污染現(xiàn)狀，為評價青貯飼料質(zhì)量以及防制的AFB1污染，為奶牛健康養(yǎng)殖提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

AFB1酶聯(lián)免疫試劑盒購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司；CT293粉碎機(jī)購自Foss公司；3K15高速冷凍離心機(jī)購自Sigma公司；MR-96A酶標(biāo)儀購自Bio Tek公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

嚴(yán)格按照國家飼料采樣標(biāo)準(zhǔn)[10]，對河南省5個地區(qū)(豫東、豫西、豫南、豫北、豫中)15個城市的69家奶牛場進(jìn)行采樣，共計采集全株玉米青貯飼料109份(表1)。

表1 樣品采集情況列表

1.2.2 樣品制備

將較大的玉米青貯用剪刀剪碎至3 cm以內(nèi)，樣品充分混勻。首先用4分法進(jìn)行樣品縮小(混合次數(shù)至少4次以上)，混合均勻后把樣品4等分然后取對角2份樣品，將分離得到的樣品放入盤中進(jìn)行稱重，然后65 ℃烘箱烘干至少8小時，再次稱重。將烘干的樣品全部粉碎、過篩后封存待檢。

1.2.3 樣品中AFB1的萃取

每份稱取粉碎好的樣品5 ± 0.01 g倒入50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇水溶液，用渦旋儀使樣品和甲醇充分混合，然后靜置1小時，使飼料中的AFB1充分萃取，離心進(jìn)行物質(zhì)分層，上層為上清液，下層為全株玉米粉末，上清液為待檢樣品。

1.2.4 樣品中AFB1的檢測(酶聯(lián)免疫吸附法)

(1)將板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，未使用的板條用自封袋密封，保存于2～8 ℃環(huán)境中；

(2) 將50 μL各標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液分別加入對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品/樣品孔中；

(3) 在每孔中加入50 μL顯色酶標(biāo)記物工作液；

(4) 在每孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)抗體工作液；

(5) 蓋好蓋板膜，輕輕震蕩酶標(biāo)板10 s充分混勻，室溫下(25±2 ℃)避光反應(yīng)30 min；

(6) 揭開蓋板膜，倒掉板孔中液體，在每孔中加入260 μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15～30 s；

(7) 倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干；

(8) 立即在每孔中加入 標(biāo)準(zhǔn)A液和B液1∶1的混合液100 μL；

(9) 蓋好蓋板膜輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s充分混勻，室溫下(25±2 ℃)避光反應(yīng)15～20 min；

(10) 揭開蓋板膜，在每孔中加入50 μL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，充分混勻；

(11) 終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長450 nm和630 nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果

參照試劑盒的檢測限3 μg/kg，109份樣品的檢測結(jié)果顯示39份為陰性樣品，70份為陽性樣品。70份陽性樣品中，其中有5份樣品在我國規(guī)定飼料的限量值(30 μg/kg)以上，超標(biāo)樣品檢測結(jié)果見表2。

表2 超標(biāo)樣品的檢測結(jié)果

2.2 統(tǒng)計分析結(jié)果

不同地區(qū)樣品檢出率、超標(biāo)率、場檢出率、場超標(biāo)率、平均值和最大值等數(shù)據(jù)見表3?？傮w樣品陽性率為64.22%(70/109)，總體奶牛場陽性率為66.67%(46/69)，總計有5份樣品AFB1含量超出我國規(guī)定的飼料AFB1限量值(30 μg/kg)?？傮w樣品超標(biāo)率為4.59%(5/109)，46個陽性場中有4個場樣品中的AFB1含量超出我國規(guī)定的飼料限量，總體場超標(biāo)率為5.80%(4/69)。

5個地區(qū)的樣品陽性率由低到高依次為豫西(36.84%)、豫中(57.89%)、豫南(58.33%)、豫北(75.00%)和豫東(92.30%)；樣品超標(biāo)率由低到高依次為豫西(0%)、豫南(0%)、豫中(5.26%)、豫北(6.81%)和豫東(7.69%)；樣品中AFB1平均含量由低到高依次是豫西(2.92 μg/kg)、豫南(4.84 μg/kg)、豫中(7.74 μg/kg)、豫北(10.11 μg/kg)和豫東(11.59 μg/kg)。

3 討論與結(jié)論

此次調(diào)查結(jié)果顯示總體樣品陽性率為64.22%，總體樣超標(biāo)率為4.59%；用卡方檢驗統(tǒng)計法得知河南省不同地區(qū)樣品陽性率和超標(biāo)率差異顯著(P≤0.05)，5個地區(qū)的樣品陽性率為豫西36.84%、豫中57.89%、豫南58.33%、豫北75.00%、豫東92.30%，樣品超標(biāo)率豫西0%、豫南0%、豫中5.26%、豫北6.81%、豫東7.69%，這表明河南省5個地區(qū)奶牛場青貯飼料AFB1污染分布廣泛，但總體污染程度較輕，其中豫東、豫北、豫中地區(qū)污染相對較為嚴(yán)重。該結(jié)果與近年來其他學(xué)者研究結(jié)果一致，劉鳳蘭等[10]調(diào)查2017年我國部分地區(qū)飼料及飼料原料中霉菌毒素的污染情況，發(fā)現(xiàn)青貯飼料和發(fā)酵料AFB1檢出率90.7%，超標(biāo)率為0%，結(jié)果表明青貯飼料和發(fā)酵料存在AFB1輕度污染。李思齊等[11]采集了魯北地區(qū)18家養(yǎng)殖場的青貯樣品，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測發(fā)現(xiàn)，AFB1檢出率55.6%，超標(biāo)率5.6%，該地區(qū)AFB1污染情況較輕。吳開開等[12]調(diào)查了甘肅部分地區(qū)規(guī)模化奶牛場飼料霉菌毒素的污染情況，青貯玉米秸中AFB1檢出率為78.43%，結(jié)果表明青貯玉米秸中存在霉菌毒素輕度污染。

表3 河南省青貯飼料中AFB1不同地區(qū)調(diào)查情況

青貯飼料制作的多個環(huán)節(jié)都有可能引起霉菌污染，如新鮮的玉米密封發(fā)酵制成青貯的過程中，如果制作流程不規(guī)范或儲存不當(dāng)，高溫高濕的環(huán)境很容易滋生霉菌，從而產(chǎn)生霉菌毒素。因此，在青貯收割儲存過程中，要嚴(yán)格做好青貯AFB1污染防制工作，減少和避免AFB1對人類健康造成的危害。

飼料中霉菌毒素分布存在不均勻性和動態(tài)性，取樣環(huán)節(jié)易產(chǎn)生的較大誤差，因此樣品的采集和制備非常重要。為了減少采樣過程中造成的誤差，采樣人必須佩戴一次性手套，不同樣品間更換手套，防止交叉污染，并隨時清潔采樣工具。在樣品采集時，按照國標(biāo)要求[13]，反芻動物青貯粗飼料的最小實驗室樣品采樣量應(yīng)大于1 kg，進(jìn)行青貯窖、青貯堆內(nèi)采樣時應(yīng)確保產(chǎn)品的各層均被覆蓋，采用9點采樣法進(jìn)行采樣。

為了減少霉菌毒素的危害，在收取、保存玉米青貯時，要注意以下幾點：在收取青貯時要注意天氣、溫度、濕度，盡量選擇在天氣干燥，無雨水時期收刈，收取青貯時應(yīng)該剔除發(fā)霉的全株玉米。李寶明等[14,15]研究認(rèn)為，添加乳酸菌能夠加快玉米青貯的發(fā)酵酸化過程，不僅快速降低了PH值，使雜菌生存受到抑制，AFB1的產(chǎn)生受到約束，減短腐敗菌有氧發(fā)酵3至5天，而且還降低了5%～10%營養(yǎng)物質(zhì)的損失。不僅如此，李旭業(yè)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌制備青貯全株玉米能顯著提高飼料的粗蛋白含量。因此，制作青貯飼料時，可加入乳酸菌種等適量發(fā)酵劑。

通過此次調(diào)查，在一定程度揭示了2019—2020年河南地區(qū)奶牛場全株玉米青貯AFB1的污染情況。值得廣大奶牛場注意的是2021年7月份以來河南省雨水過多，時間過長，導(dǎo)致多地玉米、花生的生長受到影響，外觀霉變現(xiàn)象嚴(yán)重，這提醒我省奶牛場更要注意飼料的收儲工作，做好防霉和脫霉工作，以保障牛群健康和養(yǎng)殖效益。