袁莉霞，王芙蓉，劉 姝，孫 妍，樓天靈

（浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100）

烏藥［Lindera aggregate（Sims）Kosterm］為新“浙八味”之一，因產(chǎn)于浙江天臺(tái)，故名臺(tái)烏藥，其塊根有行氣止痛、降脂、護(hù)肝等功效［1，2］。由于道地烏藥的使用量日趨增多，且缺乏集中化保護(hù)，使得道地烏藥蘊(yùn)藏量日趨減少，因此集約化管理迫在眉睫。據(jù)《本草綱目》記載，“其直根者不堪用”［3］，且其生長(zhǎng)年份較長(zhǎng)，因此在種質(zhì)選取中存在較大難度。

DNA條形碼技術(shù)已廣泛用于各物種分類鑒定、親緣性及多樣性分析等。該技術(shù)不受形態(tài)和發(fā)育狀態(tài)的影響，準(zhǔn)確度高，分類依據(jù)可靠，在植物鑒定中已取得顯著成效［4-6］。matK為植物DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)序列之一，能夠有效對(duì)植物屬間及屬以上級(jí)別進(jìn)行鑒定［7］，對(duì)近緣性物種也有較好的分辨能力［8］。滕艷芬等［9］通過分析同屬間5種石斛的葉綠體matK基因序列，成功將正品與混淆品區(qū)分開。劉靜等［10］通過不同的石斛及密花石豆蘭的matK序列分析發(fā)現(xiàn)，matK基因可用于種及變種之間的鑒別。鄭輝等［11］以ITS2+matK序列對(duì)峨眉山區(qū)唇形科藥用植物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS2+matK序列能夠快速、準(zhǔn)確鑒定并闡明物種之間的親緣關(guān)系。Alaklabi等［12］利用葉綠體matK和質(zhì)體rbcL基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該基因序列可用于蘆薈及其近緣物種的鑒定。王瑞嫻等［13］利用matK序列對(duì)7份桑葉進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明桑樹品種間的遺傳多樣性低于其他植物。

目前，matK基因在烏藥鑒定中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究從生物信息學(xué)角度對(duì)烏藥matK基因編碼蛋白進(jìn)行分析，并通過序列聚類方法，完成遺傳進(jìn)化及多樣性分析，為烏藥種質(zhì)資源鑒別、分類及多樣性研究提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

從NCBI獲取的11種山胡椒屬matK基因序列為研究對(duì)象，這11個(gè)物種分別為烏藥（Lindera aggregata），登 錄 號(hào)：AB442057.1；桂 皮 釣 樟（Lindera benzoin），登錄號(hào)：MG220997.1；香葉樹（Lindera communis），登錄號(hào)：AF244405.1；綠葉甘植（Lindera fruticosa），登錄 號(hào)：AF244405.1；黑殼 楠（Lindera megaphylla），登錄號(hào)：AF244404.1；滇粵山胡椒（Lindera metcalfiana），登錄號(hào)：AF244403.1；三椏烏藥（Lindera obtusiloba），登錄號(hào)：AF244402.1；山橿（Lindera reflexa），登錄號(hào)：AF244401.1；天全釣樟（Lindera tienchuanensis），登錄號(hào)：AF244399.1；山胡椒（Lindera glauca），登錄號(hào)：AB442056.1；三股筋香（Lindera thomsonii），登錄號(hào)：AF244400.1。

1.2 數(shù)據(jù)分析

利用NCBI ORFfinder在線工具對(duì)烏藥matK基因進(jìn)行分析，通過DNAman軟件和ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)編碼氨基酸；利用Protscale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）、SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）及TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析烏藥matK蛋白的親/疏水性、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域；利用GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）和SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)烏藥matK蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用MEGA7軟件對(duì)烏藥等11種matK基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 開放閱讀框及氨基酸預(yù)測(cè)

利用NCBI ORFfinder對(duì)烏藥matK基因的開放閱讀框進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。烏藥matK基因序列長(zhǎng)度為1 628 bp，包含14個(gè)開放閱讀框，其中ORF1的長(zhǎng)度為1 545 bp，起始密碼子位于1 bp的位置，終止密碼子位于1 524 bp的位置。利用DNAman對(duì)matK基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其所編碼的氨基酸個(gè)數(shù)為507個(gè)（圖2）。

圖1 烏藥matK基因的開放閱讀框分析

圖2 烏藥matK基因及編碼氨基酸序列

通過ProtParam分析發(fā)現(xiàn)，烏藥matK的分子式為C2757H4209N743O735S12，相對(duì)分子質(zhì)量為59 839，其中Leu占比最高，為12.23%（62/507）；其次為Ser、Ile和Phe，分 別 為11.64%（59/507）、8.28%（42/507）和8.09%（41/507）；Met和Cys占比最低，均為1.18%（6/507）（圖3）。

圖3 烏藥matK的氨基酸組成

2.2 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

烏藥matK的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存在極性氨基酸，這些氨基酸對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)一定有影響。利用Protscale對(duì)編碼的氨基酸序列進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果表明該蛋白的親水指數(shù)為-0.200，為親水蛋白（圖4）。利用SignalP4.1對(duì)matK序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白第8號(hào)位上的氨基酸S值最大，為0.486；第21號(hào)位上Y值和C值均最大，分別為0.307和0.242；S值平均為0.385，小于0.5，這表明該蛋白不存在信號(hào)肽（圖5）。通過對(duì)matK跨膜預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白膜內(nèi)外的比例為100∶1（圖6），表明該蛋白不具備細(xì)胞間信號(hào)傳遞的能力。

圖4 烏藥matK的親/疏水性

圖5 烏藥matK的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖6 烏藥matK的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過GOR IV分析發(fā)現(xiàn)，在烏藥matK的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（H）為182個(gè)，占35.90%；延長(zhǎng)線（E）為75個(gè)，占14.79%，隨機(jī)線圈（C）為250，占49.31%（圖7）。通過SWISS-MODEL對(duì)烏藥matK三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，隨機(jī)線圈分布最多，其次為Alpha螺旋，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致（圖8）。

圖7 烏藥matK的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖8 烏藥matK的三維結(jié)構(gòu)

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹

以NCBI中獲取的11種matK基因序列為對(duì)象，通過MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖9），結(jié)果表明，該進(jìn)化樹主要分為3個(gè)類群，烏藥（Lindera aggregata）與椏烏藥（Lindera obtusiloba）、三股筋香（Linderathomsonii）在第2個(gè)類群，表明烏藥與這2個(gè)物種間親緣性較高；山胡椒（Lindera glauca）與烏藥親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖9 烏藥matK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 小結(jié)與討論

matK基因進(jìn)化速度與rbcL基因相比較慢，而略快于ITS，是目前最常用的DNA條形碼序列，已被廣泛應(yīng)用于中藥鑒定［14-16］。林曉霞等［17］通過matK和rbcL序列對(duì)采集到的22份鐵皮石斛進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析和種質(zhì)的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)matK分析得到的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有更高的遺傳多樣性；Asahina等［18］通過matK和rbcL序列對(duì)石斛進(jìn)行鑒定，同樣發(fā)現(xiàn)rbcL序列的鑒定能力不如matK序列。熊哲銘等［19］通過matK序列對(duì)5種陰地蕨屬（Botrychium）藥用植物進(jìn)行了種間親緣關(guān)系分析。目前，尚未見matK基因在烏藥上的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，烏藥matK基因所編碼的蛋白開放閱讀框大小為1 545 bp，編碼的氨基酸有20種，共507個(gè)，其中占比最高的氨基酸為L(zhǎng)eu，最低的為Met和Cys。該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為52.66，親水指數(shù)為-0.200，為親水蛋白。該蛋白不存在信號(hào)肽，且不具備細(xì)胞間信號(hào)傳遞的能力。此外，通過11種山胡椒屬matK基因的進(jìn)化樹結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏藥與三股筋香的親緣性最高，與山胡椒的親緣性最遠(yuǎn)。該研究可為烏藥的種質(zhì)資源鑒別及系統(tǒng)進(jìn)化分析提供參考依據(jù)。