楊 馨，鄒德穎，張 凱，常 江，常恒禎，戰(zhàn)俊澎，郭 珣，劉益辛，程夢妍，韓 成，胡 盼，盧士英，李巖松，柳增善，任洪林

（吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點實驗室/人獸共患病研究所/動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062）

IL-1β是機體抵御病原微生物入侵，對抗炎癥反應(yīng)和組織損傷、激活和加強免疫應(yīng)答的強細胞炎性因子，還可在機體內(nèi)外誘導(dǎo)二級細胞因子（如IL-6、趨化因子）的產(chǎn)生，在宿主防御感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。IL-1β釋放的信號傳導(dǎo)通路分為兩步：首先，第一信號由Toll樣受體通過與其配體結(jié)合將信號傳至細胞內(nèi)，誘導(dǎo)IL-1β前體合成；其次，第二信號外源ATP與P2X7受體結(jié)合，激活NLRP3炎性小體，將pro-IL-1β剪切為有生物活性的IL-1β并分泌到細胞外［2］。胞質(zhì)中IL-1β與白細胞介素-1受體（IL-1R）結(jié)合，通過MyD88/IRAK/TRAF6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，激活NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而導(dǎo)致參與炎癥、宿主防御、凋亡抑制和組織修復(fù)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生［3］。

布魯氏桿菌（Brucella）感染引起的人獸共患病，至今仍然在世界范圍內(nèi)流行，特別是在發(fā)展中國家［4］。布魯氏桿菌作為一種兼性胞內(nèi)寄生菌，通過在宿主細胞內(nèi)形成含布魯氏桿菌的布氏小體（BCV），與溶酶體結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成一個安全的細胞內(nèi)生態(tài)位并進行高效復(fù)制，從而避免被宿主免疫系統(tǒng)清除，不產(chǎn)生對細菌生存有害的強烈炎癥，最終導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染，是布魯氏桿菌病治療和預(yù)防的難點［5］。利用不同毒力布魯氏桿菌菌株感染綿羊，發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-1Ra出現(xiàn)差異性表達，進而推測IL-1β在布魯氏桿菌胞內(nèi)寄生感染中發(fā)揮一定的作用［6］。因此，為研究IL-1β是否為布魯氏桿菌在宿主細胞內(nèi)維持存活提供條件，本試驗利用豬種布魯氏桿菌S2侵染RAW264.7細胞建立感染模型，檢測IL-1β在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上表達量變化，結(jié)合胞內(nèi)細菌計數(shù)結(jié)果，初步探討IL-1β與布魯氏桿菌胞內(nèi)寄生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3月齡雌性新西蘭兔購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 菌種與試劑 豬種布魯氏桿菌弱毒疫苗S2株（Brucellasuis S2）、小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和表達載體pET-28a（+）由吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點實驗室保存?？寺≥d體pMD18-T、連接酶SolutionⅠ、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix和2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox購自北京聚合酶生物科技有限公司。HRP標記的山羊抗兔IgG均購于Immunoway Biotechnology公司。重組Anti-GAPDH抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1IL-1β基因擴增 取小鼠肺組織0.2 g迅速磨碎，按照100 mg/mL加入Trizol試劑，提取總RNA；再反轉(zhuǎn)錄操作得到cDNA，-80℃保存。根據(jù)NCBI發(fā)布的小鼠IL-1β基因序列（NM_008361.4），利用Primer 6.0設(shè) 計 引 物，上 游 引 物 為F：5′-TGC TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA TATAATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′（下 劃線部分為XbaⅠ酶切位點），下游引物為R：5′-CCGCTCGAGTTAGGAAGACACGGATTCCATGGTG-3′（下劃線部分為XhoI酶切位點），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR擴增產(chǎn)物回收并連接克隆載體pMD18-T，同時將測序鑒定的陽性克隆保種備用。

1.2.2 構(gòu)建表達載體及目的蛋白的分離純化 將驗證正確的pMD18-T-IL-1β質(zhì)粒與原核表達載體pET-28a（+）分別用XbaⅠ和XhoⅠ進行酶切，10%的瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段，用SolutionⅠ于16℃連接過夜；再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素的固體LB平板上，挑取單克隆，培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌液PCR后，選取陽性克隆子測序，測序鑒定正確后命名為pET-28a-IL-1β。

1.2.3 誘導(dǎo)重組蛋白表達及純化 將重組質(zhì)粒pET-28a-IL-1β轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆菌株，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5～0.6，1∶1 000的比例加入1 mol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），16℃下140 r/min誘導(dǎo)24 h。收集的菌體在冰浴條件下進行超聲破碎至澄清透亮，收集超聲后的上清液和沉淀制樣進行SDSPAGE分析。再利用His標簽鎳離子蛋白純化柱對重組蛋白進行純化，洗脫雜蛋白，收集目的蛋白并透析濃縮，最后利用BCA蛋白定量檢測試劑分析蛋白濃度。

1.2.4 兔源多克隆抗體的制備及效價測定 選擇3月齡3 kg的新西蘭兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，耳緣靜脈采集血，收集陰性血清。首免（0 d）按1.0 mg/只將重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化，進行背部皮下多點注射。每7 d以0.5 mg/只將重組蛋白配伍等體積的弗氏不完全佐劑，加強免疫。42 d時進行心臟采血，收集血清-80℃保存。

將重組蛋白按每孔5μg/mL包被于ELISA板中，4℃過夜后加入5%脫脂乳37℃封閉1 h。PBST洗滌3次，將制備的多克隆抗體血清從1∶1 000倍比稀釋至1∶512 000依次加入，免疫前血清作為陰性對照，PBS溶液作為空白對照，孵育1 h。二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀釋，最后加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺（TMB）反應(yīng)8 min后加入50μL終止液，利用酶標儀測定OD450nm。

1.2.5 多克隆抗體特異性分析 利用LPS刺激RAW264.7細胞8 h，加入裂解液收集細胞總蛋白，與重組蛋白進行SDS-PAGE和Western blot試驗。一抗多克隆血清按1∶1 000稀釋，二抗是HRP標記的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀釋。

1.2.6 布魯氏桿菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7模型建立 將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以每孔106個鋪于6孔板，培養(yǎng)過夜。用豬種布魯氏桿菌弱毒株S2以MOI=1∶100（細菌∶細胞）對細胞進行侵染，4 h后棄去培養(yǎng)基，利用PBS洗滌細胞3次并加入含有1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作用1 h后，此時計為0 h。收集0、4、8、12、24 h細胞，用含0.5%TrizonX-100裂解細胞，梯度稀釋，涂板，每組試驗重復(fù)3次，計算不同時間段的CFU。

1.2.7 熒光定量PCR檢測 在布魯氏桿菌侵染RAW264.7細胞過程中，分別在0、4、8、12、24 h棄去培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol試劑提取細胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用Premier 6.0設(shè)計IL-1β和MyD88定量引物（表1），β-action作為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR檢測各基因的mRNA表達水平。PCR反應(yīng)體系：2×M5 HiPer Realtime PCR Super 10μL、cDNA 1μL、引物各0.5μL、ddH2O 8μL。利用2-△△Ct方法計算目的基因在不同時間段的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物

1.2.8 Western blot檢測 在侵染0、4、8、12和24 h后，棄去細胞培養(yǎng)基，每孔加入200μL裂解液，冰上裂解30 min，于4℃下1 200 r/min離心15 min，取上清液，用BCA蛋白試劑盒檢測濃度。取等量的蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進行Western blot檢測，以GAPDH為參照蛋白，并用Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算蛋白質(zhì)相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體p ET-28a-IL-1β的構(gòu)建

10%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在810 bp處出現(xiàn)擴增條帶（圖1）。將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-IL-1β，進行XbaⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，在810 bp處得到目的條帶（圖2），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 IL-1βPCR擴增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒p ET-28a-IL-1β酶切鑒定

2.2 重組蛋白IL-1β表達純化

將菌液超聲破碎后，離心收集上清液和沉淀并進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，上清液和沉淀均能觀察到大小約31 ku的目的條帶，與預(yù)期大小相符，且重組蛋白主要在上清液中表達。通過鎳柱對重組蛋白進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE鑒定，在約31 ku處可見目的蛋白條帶（圖3）。

圖3 重組IL-1β的SDS-PAGE分析

2.3 兔源多克隆抗體血清效價和特異性檢測

利用純化的重組蛋白免疫小鼠5次后，采用ELISA方法檢測血清中多克隆抗體效價。以未免疫前兔血清為陰性對照，當(dāng)稀釋至1∶25 600時，OD450nm為0.678，大于陰性對照的2.1倍，表明制備的多克隆抗體效價較高。

以收集的LPS刺激RAW264.7細胞的蛋白作為天然蛋白，與重組蛋白分別作為抗原，制備的多抗血清為一抗（1∶1 000稀釋）進行Western blot檢測。結(jié)果表明，兩組在31 ku處均出現(xiàn)明顯的特異性條帶（圖4）。

圖4 重組蛋白的多克隆抗體Western blot鑒定

2.4 布魯氏桿菌侵染RAW264.7細胞IL-1β和MyD88 mRNA轉(zhuǎn)錄差異分析

將生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞利用豬種布魯氏桿菌S2進行侵染，通過熒光定量PCR檢測IL-1β和MyD88的相對表達量。與正常組相比，S2組的IL-1β、MyD88均呈上調(diào)表達，IL-1βmRNA隨著侵染時間延長，先降低，至24 h快速升高；MyD88mRNA隨著侵染時間延長，先降低，至24 h再升高（圖5）。

圖5 IL-1β和MyD88在不同時間的mRNA表達量

2.5 布魯氏桿菌侵染RAW264.7細胞IL-1β蛋白表達差異分析

Western blot分析發(fā)現(xiàn)，在感染0至4 h IL-1β表達量無明顯變化，8～12 h IL-1β表達量顯著上升（圖6），提示布魯氏桿菌作為胞內(nèi)寄生菌，可能通過削弱侵染前期IL-1β上調(diào)表達為其在胞內(nèi)寄生創(chuàng)造適宜的環(huán)境，待布魯氏桿菌在細胞穩(wěn)定存在后，仍會刺激IL-1β上調(diào)表達。

圖6 Western blot檢測IL-1β蛋白表達量

2.6 布魯氏桿菌胞內(nèi)CFU計數(shù)

豬種布魯氏桿菌S2株侵染巨噬細胞RAW264.7后，其細胞內(nèi)細菌數(shù)變化如圖7所示。布魯氏桿菌在胞內(nèi)的存活能力持續(xù)下降，數(shù)量呈下調(diào)趨勢，但變化強度與感染時間有關(guān)。侵染0～4 h時，巨噬細胞發(fā)揮強勁的殺傷力，絕大部分布魯氏桿菌死亡，胞內(nèi)細菌快速減少。待侵染8～12 h后，內(nèi)體布氏小體（eBCVs）逐漸向有利于布魯氏桿菌在宿主細胞內(nèi)復(fù)制布氏小體（rBCVs）轉(zhuǎn)換［7］，同時IL-1β蛋白表達量仍在增加，炎癥反應(yīng)持續(xù)，因此胞內(nèi)布魯氏桿菌數(shù)量減少的趨勢變緩。侵染到達12～24 h，細胞內(nèi)MyD88和IL-1β明顯上調(diào)，炎癥反應(yīng)加劇，細胞對布魯氏桿菌的清除力度加大，胞內(nèi)細菌數(shù)再次快速下降。

圖7 布魯氏桿菌S2株在RAW264.7細胞內(nèi)的增殖

3 小結(jié)與討論

截至2021年5月，中國共報告布病26 919例，且病例數(shù)呈現(xiàn)波動上升趨勢［8］。人類感染布病主要是通過直接接觸感染動物及含菌的分泌物，或攝入感染動物制品，如未經(jīng)消毒的牛奶、未煮熟的牛羊肉等。布魯氏桿菌感染會引起人出現(xiàn)以發(fā)熱、疲勞、虛弱和體重減輕為特征的炎癥性疾?。淮菩詣游锪鳟a(chǎn)或產(chǎn)死胎、弱胎；雄性動物睪丸炎或附睪炎，喪失種用價值［9］。目前，動物布病的主要預(yù)防手段是接種疫苗，但無法準確區(qū)別布病感染與免疫，造成大量免疫動物因血清陽性反應(yīng)而懷疑感染，對全球的畜牧業(yè)經(jīng)濟造成巨大損失，影響社會公共衛(wèi)生安全［10］。因此，探討影響布魯氏桿菌在宿主細胞內(nèi)寄生的因素，對進一步防控和治療布病起到重要的作用。

IL-1β是一種強促炎細胞因子，可由多種細胞合成與分泌，具有廣泛的生物學(xué)作用，不僅能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化并提高其功能，還能促進其他炎癥因子的釋放，維持和放大炎癥反應(yīng)［11］。研究表明，布魯氏桿菌感染RAW 264.7能誘導(dǎo)IL-1β的顯著表達［12，13］。IL-1β是布魯氏桿菌急性感染期敏感指標［14］。因此，本研究選取小鼠IL-1β的CDS區(qū)進行原核表達，利用pET-28a構(gòu)建表達載體，16℃下利用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，可在上清液中誘導(dǎo)出大量重組蛋白。經(jīng)鎳柱純化后，可得到無雜帶且純度較高的重組蛋白。通過免疫新西蘭兔制備的多克隆抗體制能與重組蛋白IL-1β以及小鼠天然IL-1β結(jié)合，特異性好，可用于后續(xù)試驗。

MyD88作為胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過募集IL-1R相關(guān)蛋白激酶（IRAK）等具有死亡結(jié)構(gòu)域的信號分子，參與IL-1R和TLR誘導(dǎo)NF-kB途徑［15］。研究表明，MyD88的破壞和結(jié)構(gòu)改變會降低對IL-1β應(yīng)答，緩解炎癥反應(yīng)［16，17］。MyD88在機體清除綿羊布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌和牛種布魯氏桿菌過程中發(fā)揮不可或缺的作用［18-20］。因此，在探討布魯氏桿菌侵染過程中IL-1β差異表達的同時，關(guān)注MyD88變化趨勢，為后續(xù)研究IL-1β和MyD88基因的干擾或過表達對布魯氏桿菌胞內(nèi)寄生的影響提供思路。

在布魯氏桿菌感染初期，巨噬細胞可發(fā)揮其殺傷功能，殺滅絕大部分侵入的細菌，少量存活的細菌仍會刺激細胞激活炎癥反應(yīng)，提高IL-1β表達量，促進細胞對細菌的清除，但MyD88的作用有待進一步驗證。