程嬌梅，齊祥明，郭曉華

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266000；3.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276826)

1 引言

乙醇是很多酒精發(fā)酵液中的重要甚至是主要目標(biāo)產(chǎn)物，乙醇含量往往是對(duì)這些發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行表征的重要指標(biāo)之一。因此，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定乙醇含量對(duì)這類發(fā)酵工藝的優(yōu)化與控制具有重要意義。傳統(tǒng)的乙醇含量測(cè)定方法主要是通過(guò)密度原理進(jìn)行檢測(cè)[1]，需要對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾處理，操作過(guò)程復(fù)雜，所需樣品量相對(duì)較大，且測(cè)量結(jié)果不夠準(zhǔn)確，容易受溫度以及糖等可溶性物質(zhì)的影響。

目前，對(duì)于各種有機(jī)成分的快速、精確定量，往往習(xí)慣使用氣相色譜或液相色譜。盡管有很多文獻(xiàn)報(bào)道了采用氣相、液相色譜對(duì)酒精發(fā)酵醪中多種有機(jī)成分的分析[2～4]，然而目前采用色譜法對(duì)其中乙醇成分進(jìn)行定量檢測(cè)的方法報(bào)道卻非常少。僅有的幾篇報(bào)道[5～9]，主要面向的樣品通常為酒精飲料和醇基燃料。一些最新的文獻(xiàn)以及國(guó)標(biāo)[5,6]多采用氣相色譜法，該類方法固然精確，但往往需要高純氮?dú)庾鳛檩d氣，運(yùn)行成本偏高，不適合工業(yè)上酒精發(fā)酵醪的常規(guī)檢測(cè)需求。另幾項(xiàng)液相色譜檢測(cè)法的文獻(xiàn)中[7～9]，在原料基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的情況下，前處理過(guò)程都不夠快捷和簡(jiǎn)便，且所用流動(dòng)相往往為丙酮甚至乙腈等有機(jī)溶劑與水的混合物，運(yùn)行、管理成本同樣較高，也不符合綠色、環(huán)保的發(fā)展需求。

針對(duì)以上情況，本文通過(guò)對(duì)比選用了ShodexRSpak KC-811色譜柱，采用高效液相色譜，基于稀硫酸水溶液作為流動(dòng)相，建立一種前處理簡(jiǎn)單、分析過(guò)程快速、分析結(jié)果精確可靠的乙醇定量檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

乙醇發(fā)酵液：青島蔚藍(lán)生物股份有限公司2019年2～12月采用釀酒酵母發(fā)酵所得的11批乙醇發(fā)酵液。分析用水，自制純凈水；硫酸：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥試劑有限公司；乙腈：色譜純，Merck公司；乙醇：色譜級(jí)(≥99.8%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2 儀器

美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的e2695高效液相色譜儀，主要包括四元梯度泵、2414示差折光檢測(cè)器、柱溫箱等。

2.3 樣品前處理方法

取樣品溶液適量，用水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?稀釋后乙醇含量大約為3 g/L)，12000 r/min離心5 min，用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾。

2.4 色譜分析條件

2.4.1 色譜條件A

色譜柱：ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動(dòng)相：5 mmol/L硫酸溶液；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度35 ℃。

2.4.2 色譜條件B

色譜柱：ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動(dòng)相：乙腈：水=75∶25(V∶V)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度35 ℃。

2.4.3 色譜條件C

色譜柱：Waters suger-I色譜柱；流動(dòng)相：50 mg/L EDTA-鈣溶液；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫90 ℃，檢測(cè)器：示差檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度35 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)方法的對(duì)比

實(shí)驗(yàn)中首先選取了兩種常見的陽(yáng)離子色譜柱Waters Sugar-Pak I和ShodexRSpak KC-811，分別采用色譜條件C和色譜條件A進(jìn)行了乙醇含量測(cè)定可行性探索，具體結(jié)果見圖1。

圖1 不同色譜柱的色譜

如圖1所示，Waters Sugar-Pak I的乙醇保留時(shí)間(24 min)比ShodexRSpak KC-811(15min)長(zhǎng)9 min，峰形較寬，且有一定程度的拖尾。從柱溫條件上看，Waters Sugar-Pak I為90 ℃，也遠(yuǎn)高于ShodexRSpak KC-811的30 ℃。因此，從色譜結(jié)果和實(shí)驗(yàn)便捷角度考慮，決定選擇ShodexRSpak KC-811作為建立相應(yīng)乙醇含量測(cè)定方法的色譜柱。

確定選用ShodexRSpak KC-811色譜柱后，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選擇較優(yōu)的流動(dòng)相，以獲得更好的檢測(cè)條件。實(shí)驗(yàn)采用3 g/L樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比了色譜條件B(以乙腈∶水=75∶25(V∶V)為流動(dòng)相)和色譜條件A(以5 mmol/L硫酸溶液為流動(dòng)相)的乙醇檢測(cè)效果，具體結(jié)果如圖2所示。

圖2的結(jié)果顯示，在其余條件均相同的情況下，以乙腈-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，保留時(shí)間較稀硫酸水溶液縮短3min左右。然而，在化學(xué)分析相關(guān)領(lǐng)域廣為人知的是，乙腈除了是非常好的流動(dòng)相選擇之外，同時(shí)其本身還是一種毒性揮發(fā)物[10]，操作危險(xiǎn)性較高，使用后還需要較復(fù)雜的無(wú)害化處理。在綠色檢測(cè)正逐漸成為業(yè)內(nèi)共識(shí)的今天，采用乙醇、過(guò)熱水、離子液體等替代乙腈的綠色液相色譜方案非常多見[9,11～15]，但卻很少看到采用常溫水溶液的方案。

圖2 不同流動(dòng)相的色譜

本研究用稀硫酸水溶液替代乙腈-水溶液作為流動(dòng)相，除響應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)于傳統(tǒng)方案，其他各項(xiàng)性能甚至?xí)?yōu)于傳統(tǒng)方案。比如，從峰形上看，以硫酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，峰形相對(duì)更好。從峰面積上看，以硫酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，乙醇色譜峰(峰2)的峰面積為78719 μV·s，而以乙腈-水溶液為流動(dòng)相時(shí)，乙醇色譜峰(峰1)的峰面積為48969 μV·s，結(jié)果表明在樣品濃度相同的情況下，以硫酸溶液為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)值更高。因此，從色譜結(jié)果和環(huán)保角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇綠色液相色譜方案(條件A)用于乙醇含量的測(cè)定。

與文獻(xiàn)[7～9]選擇丙酮+水為流動(dòng)相等相比，本實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol/L稀硫酸水溶液為流動(dòng)相更綠色環(huán)保，不需要對(duì)后期廢液進(jìn)行特殊處理。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選擇ShodexRSpak KC-811色譜柱，采用色譜條件A進(jìn)行乙醇含量測(cè)定方法的建立，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察

配制100 g/L的乙醇溶液，進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，做峰面積-乙醇含量的線性關(guān)系。如圖3所示，采用規(guī)定的方法對(duì)乙醇進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，其濃度在0.6～6 g/L范圍內(nèi)線性良好，R2可達(dá)0.9999以上。

圖3 乙醇線性關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)以信噪比(S/N)=3對(duì)應(yīng)的含量作為檢出限，通過(guò)對(duì)樣品色譜圖基線的分析，發(fā)現(xiàn)該方法下乙醇的檢出限為11.67 mg/L。以信噪比(S/N)=10對(duì)應(yīng)的含量作為定量限，可得出乙醇定量限為40.85 mg/L。

3.2.2 精密度試驗(yàn)

取乙醇對(duì)照品溶液，在規(guī)定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。計(jì)算乙醇峰面積的RSD為0.51%，結(jié)果表明該方法的精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果乙醇峰面積的RSD為0.72%。表明供試品溶液中乙醇在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取5 個(gè)不同濃度的乙醇樣品，在規(guī)定的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積RSD的平均值為0.6%，具體見表1。結(jié)果表明，所選方法在測(cè)定樣品中乙醇濃度的重復(fù)性良好。

表1 乙醇重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

3.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知乙醇含量的樣品9 份，加入3 種不同濃度水平的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)(n=3)，具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該方法的平均加標(biāo)回收率為96.66%，回收率的RSD為1.3%，說(shuō)明回收率良好，適合于本樣品的含量測(cè)定。

表2 乙醇加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

3.3 樣品含量測(cè)定

檢測(cè)方法建立后，對(duì)檢測(cè)方法的性能進(jìn)行確認(rèn)，以保證建立的檢測(cè)方法適用樣品的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)10批乙醇發(fā)酵醪樣品(2019年2～12月)進(jìn)行了的5次平行測(cè)定，結(jié)果如表3所示，其酒精含量測(cè)定值的RSD最高為3.06%，小于5%，符合定量檢測(cè)方法要求。

表3 樣品含量測(cè)定

4 結(jié)論

本文基于色譜柱、流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化，建立了高效液相色譜法測(cè)定乙醇發(fā)酵液中乙醇含量的方法。前處理僅采用去離子水對(duì)樣品稀釋，然后用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾即可上樣。具體色譜條件為，色譜柱為ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸溶液；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為35 ℃。

試驗(yàn)進(jìn)一步確定和驗(yàn)證了該方法的線性范圍、重復(fù)性、加標(biāo)回收率等。結(jié)果表明，該分析方法在乙醇濃度0.6～6.0 g/L范圍內(nèi)線性度良好，R2=1；檢出限為11.67 mg/L；定量限為40.85 mg/L；加標(biāo)回收率為96.66%，樣品重復(fù)性(RSD)小于1.0%。發(fā)酵醪的分析結(jié)果顯示，其酒精含量測(cè)定值RSD最高為3.06%。與現(xiàn)有文獻(xiàn)的充分對(duì)比顯示：該方法樣品處理簡(jiǎn)單，對(duì)乙醇含量的測(cè)定快速、準(zhǔn)確、可靠，值得乙醇發(fā)酵領(lǐng)域檢測(cè)乙醇濃度時(shí)借鑒使用。