嚴(yán) 飛，朱冰川，徐 賧

(江蘇省無(wú)錫環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 無(wú)錫 214000)

1 引言

河流水質(zhì)主要從理化指標(biāo)、水生生物、生境狀況等角度評(píng)價(jià)[1]?，F(xiàn)有環(huán)境下物理和化學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，對(duì)污染物已經(jīng)可以進(jìn)行快速完善的測(cè)定，但環(huán)境中的污染物并非單獨(dú)存在，環(huán)境受到污染后的影響非常復(fù)雜也難以進(jìn)行快速鑒定，因此根據(jù)水生生物對(duì)水體污染快速反應(yīng)的特點(diǎn)，可以進(jìn)行水環(huán)境污染的及時(shí)預(yù)警。水生生物的研究近年來(lái)越發(fā)重要，河流中藻類(lèi)主要分為著生藻和浮游藻兩大類(lèi),著生藻類(lèi)是水體中的初級(jí)生產(chǎn)者[2]。著生藻類(lèi)是生長(zhǎng)在水下各種基質(zhì)表面上的所有藻類(lèi)[3]，是水生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分[4]，但著生藻類(lèi)的研究報(bào)道較少[5]。著生藻類(lèi)生物完整性指數(shù)的水生態(tài)健康評(píng)價(jià)技術(shù)在國(guó)外得到廣泛應(yīng)用[6]。

著生基質(zhì)是研究著生藻類(lèi)工作的基本材質(zhì)，按照采樣基質(zhì)的不同，對(duì)著生藻類(lèi)的研究可以分為天然基質(zhì)法和人工基質(zhì)法。天然基質(zhì)法是指采集位于水下的鵝卵石、碎石、高等水生植物、大型藻類(lèi)、枯枝落葉等，并從其上刮取著生藻類(lèi)，或用培養(yǎng)皿扣去河床上細(xì)沙、沉積物得到藻類(lèi)的方法到藻類(lèi)的方法[7]。受天然基質(zhì)的局限性,對(duì)著生藻類(lèi)的深入研究有限，而人工基質(zhì)主要有載玻片、瓷磚、人工水草等[8]，本文以標(biāo)準(zhǔn)面積和可知時(shí)間的人工基質(zhì)探討著生藻類(lèi)的測(cè)定。由于對(duì)人工基質(zhì)尚未有統(tǒng)一的使用標(biāo)準(zhǔn),本次實(shí)驗(yàn)主要對(duì)著生藻類(lèi)的定性、定量監(jiān)測(cè)結(jié)果以及精密性等進(jìn)行分析探討，對(duì)樣品處理和鑒定計(jì)數(shù)采用常規(guī)制片法(非硅藻樣品)和改進(jìn)的計(jì)數(shù)方法[9]。

2 方法原理

利用人工基質(zhì)(放置一段時(shí)間，讓藻類(lèi)能附著生長(zhǎng))和天然基質(zhì)采集水中著生藻類(lèi)，對(duì)采集的樣品進(jìn)行固定、濃縮，抽取樣品在顯微鏡下進(jìn)行著生藻類(lèi)的定性和定量，其中通過(guò)生物個(gè)體計(jì)數(shù)來(lái)表征單位面積藻類(lèi)個(gè)體數(shù)量(藻類(lèi)密度)，利用形態(tài)學(xué)對(duì)物種進(jìn)行定性鑒定。

3 儀器設(shè)備、試劑和材料

3.1 設(shè)備器材

毛刷、鑷子、刀片、剪刀、樣品瓶(250 mL)、標(biāo)簽紙、丙烯酸纜繩、硅藻計(jì)(由本中心提供技術(shù)參數(shù)進(jìn)行定制，載玻片尺寸2.5 cm×7.7 cm，一共8 片，總面積為300 cm2，無(wú)站內(nèi)編號(hào))，配備10×目鏡和20×、40×、100×(油鏡)物鏡的生物顯微鏡(型號(hào)：NIKON80i，站內(nèi)編號(hào)：AGS001，校準(zhǔn)日期：2018年6月11日，有效期為1 年，檢定校準(zhǔn)證書(shū)見(jiàn)附件10)，載玻片及蓋玻片、浮游生物計(jì)數(shù)框、移液槍、一次性槍頭、記號(hào)筆、膠頭滴管、乳膠手套及一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

3.2試劑藥品

(1)固定劑。魯哥氏液：40 g碘(含量≥99.8%，分析純)溶于含碘化鉀(含量≥99.0%，分析純)60 g的1000 mL水溶液中；福爾馬林：市售40%的甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，分析純)。

(2)實(shí)驗(yàn)用水。蒸餾水：新制備的超純水。

4 樣品的采集與保存

本次方法確認(rèn)于2019年3月12日在梁南橋點(diǎn)位開(kāi)始放置人工基質(zhì)(硅藻計(jì))1 個(gè)，每天查看，以確保硅藻計(jì)不丟失。3月26日收集樣品(人工基質(zhì)定性、定量樣品1個(gè)，天然基質(zhì)定性樣品1個(gè))，共計(jì)2個(gè)(采樣記錄見(jiàn)表1)。

表1 采樣記錄

4.1 樣品采集

4.1.1 定量樣品—人工基質(zhì)法

本次實(shí)驗(yàn)采用人工基質(zhì)硅藻計(jì)，在河流采樣中避開(kāi)急流和漩渦，采樣時(shí)固定好器材，保證硅藻計(jì)距離水面5～10 cm，使之得到合適的光照，每天觀察了解采樣器材放置情況，在放置14 d后進(jìn)行著生藻類(lèi)的采集，采集過(guò)程中將硅藻計(jì)從水中緩慢移出，用毛刷和刀片將載玻片表面上所有附著的著生藻類(lèi)全部刮到盛有蒸餾水的玻璃瓶中，并用蒸餾水將基質(zhì)沖洗多次，用魯哥氏液固定，貼上標(biāo)簽。此次方法確認(rèn)采用直接加入魯哥氏液固定來(lái)定量鑒定著生藻類(lèi)。

4.1.2 定性樣品—天然基質(zhì)法

采集天然基質(zhì)上的著生藻類(lèi)樣品，本次實(shí)驗(yàn)中采集基質(zhì)為卵石(85%)、樹(shù)木殘干(15%)，采集過(guò)程中將基質(zhì)從水中緩慢移出，將表面相對(duì)較為光滑和略帶綠色、藍(lán)綠色或棕黃色的部分用刀片刮取到裝有少量蒸餾水的樣品瓶中。將所有采集到的樣品混合裝入樣品瓶中，加入甲醛溶液，貼上臨時(shí)標(biāo)簽。

4.2 樣品固定和保存

(1)定性樣品固定：按100∶3的比例在樣品中加入市售的甲醛溶液。

(2)定量樣品固定：按100∶1.5的比例在樣品中加入配好的魯哥氏液，鑒定完成后按定性樣品固定液的比例加入甲醛溶液永久保存。

(3)將樣品放入密封的樣品瓶中，置于統(tǒng)一的樣品柜中保存。

4.3 標(biāo)識(shí)與記錄

(1)標(biāo)識(shí)。在樣品瓶上粘貼標(biāo)簽，標(biāo)注采樣地點(diǎn)、日期、采集人姓名、固定液類(lèi)型。在樣品記錄本上記錄與樣品編號(hào)相對(duì)應(yīng)的采樣地點(diǎn)、日期與樣品類(lèi)型。

(2)記錄。在著生藻類(lèi)采樣記錄表中記錄河流名稱(chēng)、采樣位置、采樣日期、采集人姓名、采樣方法及相關(guān)生態(tài)信息。采樣完成后，在著生藻類(lèi)樣品登記表上記錄樣品信息(表2)。

表2 著生藻類(lèi)樣品登記

5 樣品前處理和鑒定

5.1 樣品的處理和制備

5.1.1 定性樣品

常規(guī)制片法：將采集到的定性樣品根據(jù)個(gè)體密度適當(dāng)沉淀、濃縮至適宜體積，觀察時(shí)，將樣品充分搖晃均勻后，靜置5～10 s，用膠頭滴管吸取液體中間略偏下位置的樣品滴放在載玻片上，制成臨時(shí)裝片。

5.1.2 定量樣品

將采集到的樣品濃縮、沉淀后，定容至20～50 mL(根據(jù)樣品中生物的密度確定定容體積)。本次實(shí)驗(yàn)濃縮沉淀至50 mL。

5.2 鑒定和計(jì)數(shù)

所有樣品鑒定過(guò)程中參考《中國(guó)淡水藻類(lèi)——系統(tǒng)、分類(lèi)及生態(tài)》[10]。

5.2.1 定性樣品

將5.1.1 中制備的臨時(shí)裝片置于10×40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、鑒定和粗略計(jì)數(shù)。

5.2.2 定量樣品

將5.1.2 中制備的濃縮樣品充分搖晃均勻后，取0.1 mL置于浮游生物計(jì)數(shù)框中，在10×40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、鑒定和計(jì)數(shù)。

5.2.3 計(jì)數(shù)方法

本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的計(jì)數(shù)方法：對(duì)計(jì)數(shù)框中的樣品按照對(duì)角線的格進(jìn)行計(jì)數(shù)，每0.1 mL計(jì)數(shù)10個(gè)小格，重復(fù)計(jì)數(shù)3個(gè)0.1 mL，共計(jì)30 小格。

著生藻類(lèi)每片個(gè)數(shù)計(jì)算公式：

N=100×m/30

(1)

式(1)中：N為每片藻類(lèi)個(gè)體數(shù)，ind；m為30 小格總個(gè)體數(shù)量(鏡檢生物個(gè)體數(shù))，ind；30 為30 個(gè)小格；100 為計(jì)數(shù)框全片格數(shù)為100 個(gè)。

著生藻類(lèi)個(gè)體數(shù)量(藻類(lèi)密度)計(jì)算公式：

n=niV/ViS

(2)

式(2)中：n為單位面積藻類(lèi)個(gè)體數(shù)量，ind/cm2；ni為抽樣的總個(gè)體數(shù)量，ind；V為定容總體積，mL；Vi為抽樣體積，mL；S為采樣的總面積，cm2，本次實(shí)驗(yàn)采樣總面積為300 cm2。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本次方法確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2019年3月12日至4月2日，實(shí)驗(yàn)室分析結(jié)果分述如下。

6.1 天然基質(zhì)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果

定性樣品鑒定計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 著生藻類(lèi)—天然基質(zhì)定性樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

6.2 人工基質(zhì)定性、定量樣品定性、定量樣品

數(shù)據(jù)鑒定計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 著生藻類(lèi)—定量樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表一

表5 著生藻類(lèi)—定量樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表二

6.3 精密性

由于生物監(jiān)測(cè)的特殊性，本實(shí)驗(yàn)中主要針對(duì)定量樣品進(jìn)行精密性檢查，通過(guò)以下兩方面來(lái)表征。

6.3.1 平行性

由同一分析人員在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)同一樣品做平行分析，評(píng)估兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異，兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%(平行樣A見(jiàn)圖5，平行樣B見(jiàn)圖6)。由表1可知，平行樣個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)差(相對(duì)差=兩片計(jì)數(shù)結(jié)果差值/兩片計(jì)數(shù)結(jié)果中的較小值×100)為4.7%，符合“兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%”的要求[9](表6)。

表6 精密性檢查(平行性)

6.3.2 重復(fù)性

統(tǒng)一樣品、統(tǒng)一方法、統(tǒng)一分類(lèi)鑒定參考文獻(xiàn)，做不同分析人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異，兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%。由表2可知，人員比對(duì)藻類(lèi)個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)差(同上)為7.8%，符合“兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%”的要求(表7)。

表7 精密性檢查(重復(fù)性)

7 討論

本次實(shí)驗(yàn)，探討了人工基質(zhì)用于河流中著生藻類(lèi)監(jiān)測(cè)的可行性，并使用該方法對(duì)梁塘河梁南橋斷面著生藻類(lèi)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在著生藻類(lèi)定性方面，采用人工基質(zhì)監(jiān)測(cè)結(jié)果與天然基質(zhì)基本一致，藻種鑒定結(jié)果一致性達(dá)到95%；在著生藻類(lèi)定量方面，經(jīng)過(guò)精密性檢查，平行性符合“兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%”的要求，重復(fù)性符合“兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)數(shù)相差不超過(guò)15%”的要求。

總體來(lái)看，人工基質(zhì)比天然基質(zhì)在河流著生藻類(lèi)監(jiān)測(cè)方面有以下優(yōu)勢(shì)：①人工基質(zhì)比天然基質(zhì)外觀更規(guī)整，沒(méi)有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，更容易觀測(cè)分析；②人工基質(zhì)比天然基質(zhì)更具有普及性，可以統(tǒng)一基質(zhì)的材質(zhì)并且對(duì)不同水體、流域進(jìn)行橫向?qū)Ρ纫约巴凰w的不同深度縱向?qū)Ρ?；③人工基質(zhì)更易使藻類(lèi)附著，并且可以在天然基質(zhì)無(wú)法出現(xiàn)的更深水體中放置，開(kāi)展更多開(kāi)創(chuàng)性研究；④人工基質(zhì)比天然基質(zhì)更易保存，防止由于類(lèi)似木材生物質(zhì)離開(kāi)水體后的氧化腐爛對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生影響。由此可見(jiàn)，用人工基質(zhì)取代天然基質(zhì)對(duì)河流著生藻類(lèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有可行性，在今后實(shí)際工作中可以嘗試采用人工基質(zhì)開(kāi)展監(jiān)測(cè)。為繼續(xù)更深層次的著生藻類(lèi)研究、水污染預(yù)警研究、和水生生物指示劑的研究提供鋪墊和引導(dǎo)作用。