陳 悅，孫思雨，胡建忠，郝凱強(qiáng)，于 曼，吳元華，夏 博

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866；2.水利部沙棘開發(fā)管理中心，北京 100038）

沙棘Hippophae rhamnoides是一種多年生落葉灌木，廣泛分布于歐亞大陸，我國從東北、華北到西北、西南均是沙棘主栽地區(qū)[1]。我國現(xiàn)有沙棘資源200 余萬hm2，沙棘加工企業(yè)200 余家，年產(chǎn)值約70 億元[2]。沙棘適生性強(qiáng)，可以通過硬枝扦插、嫩枝扦插和嫩芽扦插等途徑進(jìn)行快速繁育[3]，適宜在我國西部荒漠化地區(qū)大面積栽培，對水土保持、防風(fēng)固沙具有重要作用，兼具重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[4]。

沙棘枝枯病又被稱為干縮病，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害沙棘的毀滅性病害之一。20世紀(jì)60年代該病在俄羅斯大面積爆發(fā)，目前已在世界沙棘主栽區(qū)廣泛流行[5]。在我國遼寧、甘肅及陜西等沙棘主要種植區(qū)均有沙棘枝枯病危害的報(bào)道[6]。最近有研究結(jié)果表明，引起黑龍江省沙棘枝枯病的病原菌為擬枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichioides[7]。擬枝孢鐮刀菌是一類具有廣泛寄主的病原真菌，可以侵染馬鈴薯、紫花苜蓿、大豆等多種經(jīng)濟(jì)作物[8-10]，能夠在植物病殘?bào)w和土壤中越冬越夏，引起玉米、薰衣草等多種植物枯萎病、腐爛病的發(fā)生[11-13]。發(fā)病植株上部葉片提前褪綠并大量脫落，在枝上形成凹陷病斑，隨后病斑連結(jié)成片，整個(gè)植株的枝條干枯皺縮，嚴(yán)重感病的植株出現(xiàn)沙棘果實(shí)提早脫落的現(xiàn)象，該病最終導(dǎo)致沙棘林木大面積死亡[14]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（quantitative realtime PCR）是基于DNA/RNA 探針技術(shù)的植物病原菌鑒定方法，在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的累積來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 反應(yīng)過程，最后再通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，與傳統(tǒng)診斷方法相比具有高度特異性[15]，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的定量分析[16-17]。傳統(tǒng)PCR 方法的靈敏度低，且采用傳統(tǒng)PCR 方法無法實(shí)現(xiàn)對環(huán)境和土壤樣品的高效定量檢測[18]，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有較高的檢測靈敏性，兼顧定性檢測和定量檢測，采用該技術(shù)能夠較為準(zhǔn)確地確定初始拷貝數(shù)[19-20]，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于定量檢測土壤和枝條病殘?bào)w中微生物含量[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在擬枝孢鐮刀菌檢測方面的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道。本研究中針對擬枝孢鐮刀菌建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系，旨在從基因水平為快速定量檢測擬枝孢鐮刀菌提供一種有效方法，對沙棘枝枯病的早期診斷、定量檢測和病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為單孢純化后的G1-5-1 擬枝孢鐮刀菌F.sporotrichioides、 核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、 炭疽菌Colletotrichumsp.、 根腫菌Plasmodiophora brassicae、絲核菌Rhizoctoniasp.、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、層出鐮刀菌Fusarium proliferatum、木賊鐮刀菌Fusarium equisetum、 三線鐮刀菌Fusarium tricinctum、赤霉菌Gibberellasp.、 擬莖點(diǎn)霉Phomopsis cauliflorum，現(xiàn)存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病毒室。

1.1.2 供試枝條樣本和土壤樣本

2020年5—7月，在甘肅省慶陽市采集17 份枝條樣本、4 份沙棘根際土壤樣本，共21 份樣本，其詳細(xì)信息見表1。

表1 供試沙棘枝條和土壤樣品Table 1 Test branch and soil samples

1.2 試劑與儀器

試劑：NaCl、無水乙醇和蔗糖購自國藥公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖和卡那霉素購自索萊寶公司；膠回收試劑盒（全式金）；DNA secure新型植物基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen）；土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen）；真菌基因組快速抽提試劑盒（生工，上海）；其他未標(biāo)注試劑均購自Vazyme 公司。

儀器：紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）、PCR 擴(kuò)增儀StepOnePlus ?（Thermofisher）、Nanodrop紫外分光光度計(jì)（Thermofish）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 制備

1）病原菌基因組DNA 的提取。在單孢純化后的菌落上打取直徑為5 mm 的菌餅，將菌餅置于PD 培養(yǎng)液中，封好封口膜，在搖床（25 ℃，110 r/min）上搖培5 d 后，用已滅菌的濾紙過濾培養(yǎng)液，將過濾出的菌絲用無菌水沖洗3 次放于50 mL 離心管中，在凍干機(jī)中凍干3 h。參照真菌基因組快速抽提試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA。取20 mg 干燥的子實(shí)體或菌絲放入研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉末，加入到1.5 mL離心管中。加入400 μL Buffer Digestion 和4 μL β-巰基乙醇，振蕩混勻。65 ℃水浴1 h，至細(xì)胞完全裂解。加入200 μL Buffer PF，充分顛倒混勻，在冰箱（-20 ℃）中放置5 min。室溫條件下，10 000 r/min 離心5 min，將上清液（500 ～550 μL）轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒5 ～8 次使之充分混勻，室溫條件下放置2 ～3 min。室溫條件下，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液。加入1 mL 75%的乙醇，顛倒漂洗1 ～3 min，10 000 r/min 離心2 min，棄上清，重復(fù)1 次該操作步驟。開蓋，室溫條件下倒置5 ～10 min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA 用50～100 μL TE Buffer溶解，并在-20 ℃條件下保存。

2）植物基因組DNA 的提取。參照DNA secure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒說明書提取植物基因組DNA。取植物干組織20 mg 放入研缽中，倒入少量液氮，充分碾磨，加入400 μL 緩沖液LP1 和6 μL RNase A（10 g/L），放入離心管中，旋渦振蕩1 min，室溫條件下放置10 min。加入130 μL 緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min。12 000 r/min 離心5 min，將上清液移至新的離心管中。加入1.5 倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩15 s，使之混勻，可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。將所得溶液和絮狀沉淀均加入吸附柱CB3 中，1 200 r/min 離心30 s，棄廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，1 200 r/min 離心30 s，棄廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中，重復(fù)該操作步驟多次。然后1 200 r/min 離心2 min，棄廢液。吸附柱CB3 在室溫條件下放置2 min，徹底晾干殘余的漂洗液。將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 ～200 μL 洗脫緩沖液TE，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min 離心2 min，將溶液收集到離心管中。

3）土壤微生物基因組DNA 的提取。參照土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen）說明書提取土壤微生物基因組DNA。向Power Bead Tube 中加入0.25 g 土壤樣品，輕輕攪拌。加入60 μL 的C1，渦旋振蕩數(shù)秒。24 位旋渦適配器水平固定，高速渦旋10 min，12 000 r/min 離心30 s。將上清液移到2 mL 收集管中，加入250 μL C2 渦旋5 s，在2 ～8 ℃條件下靜置5 min。12 000 r/min離心1 min，將600 μL 上清液移到2 mL 收集管中。加入200 μL C3 并渦旋5 min，在2 ～8 ℃條件下靜置5 min。12 000 r/min 離心30 s，將750 μL 上清液移到2 mL 收集管中。搖勻C4，加入1 200 μL上清液，渦旋5 s。取該溶液675 μL 加入MB 旋轉(zhuǎn)柱離心管中，12 000 r/min 離心30 s，棄掉流出液，重復(fù)該操作步驟多次，處理所有樣品。添加500 μL 的C5，12 000 r/min 離心30 s。棄掉流出液，12 000 r/min 再次離心1 min。將MB 旋轉(zhuǎn)柱放入2 mL收集管中，加入100 μL的C6到白色濾膜中央。在室溫條件下12 000 r/min 離心30 s，棄掉MB 旋轉(zhuǎn)柱，試管中的DNA 可用于下一步試驗(yàn)。

1.3.2 常規(guī)PCR 反應(yīng)

根據(jù)熒光定量PCR 引物的設(shè)計(jì)原則，使用Primer 5 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)引物序列為QS-2F（5′-CATCATTCGAATCGCTCTCA），和QS-2R（5′-GGGTATGAGCCCCACTATCA），由上海生工生物公司（長春）合成。

以總DNA 為模板，加入所設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性引物，對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL 2×Taq Master Mix、8.2 μL ddH2O、1 μL 總DNA、0.4 μL primer-F（10 μmol/L）、0.4 μL primer-R（10 μmol/L），反應(yīng)體系總體積為20 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30 ～35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.3 目的片段載體連接與熱激轉(zhuǎn)化

1）膠回收與載體連接。參照天根公司提供的膠回收試劑盒說明書進(jìn)行切膠回收。向吸附柱CA2 中加入500 μL 平衡液BL，12 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將單一的目的DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱取其質(zhì)量。向膠塊中加入等體積的PN 溶液，50 ℃水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液加入吸附柱CA2 中，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min 離心30 ～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2 放入收集管中。向吸附柱CA2 中加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CA2 放入收集管中，重復(fù)1 次該操作步驟。將吸附柱CA2 放回收集管中，12 000 r/min 離心2 min，除盡漂洗液后，在室溫條件下放置晾干；再將吸附柱CA2 放到離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，在室溫條件下放置2 min。12 000 r/min 離心2 min，收集DNA溶液。連接體系為4 μL 回收產(chǎn)物DNA、0.5 μL pEASY-T1 simple 載體、無菌水0.5 μL，總體積5 μL，反應(yīng)5 min（25 ℃）。

2）熱激轉(zhuǎn)化。將上述產(chǎn)物加入50 μL trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20 ～30 min。42 ℃金屬浴熱激30 s，反應(yīng)結(jié)束后立即將產(chǎn)物冰浴2 min。將250 μL 液體LB 培養(yǎng)基加入上述體系中，在37 ℃條件下200 r/min 培養(yǎng)1 h。3 000 r/min 離心1 min，棄掉150 μL，輕彈混勻，取50 μL 均勻涂布到含50 mg/L 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上。

3）陽性菌落檢測和測序。挑選單菌落加入到1 mL 含50 mg/L 卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下200 r/min 培養(yǎng)7 ～8 h。取1 μL 菌液作為模板加入到PCR（20 μL 體系）預(yù)混液中，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。將檢測到的陽性克隆質(zhì)粒送到上海生工生物公司（長春）測序。

4）質(zhì)粒提取。按照天根公司提供的試驗(yàn)方法進(jìn)行質(zhì)粒提取。向吸附柱CP3 中加入500 μL 平衡液BL，12 000 r/min 離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取1 ～5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12 000 r/min 離心1 min，吸除上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μL的P1 溶液，使用渦旋振蕩器使懸浮細(xì)菌徹底沉淀。向離心管中加入250 μL 的P2 溶液，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 ～8 次，使菌體充分裂解。再加入350 μL 的P3 溶液，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 ～8 次，使之充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12 000 r/min 離心10 min。將收集的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3 中，盡量不要吸出沉淀。12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。向吸附柱CP3 中加入500 μL去蛋白液PD，12 000 r/min離心30～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 重新放回收集管中。再加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中，重復(fù)該操作步驟多次。將吸附柱CP3 放入收集管中，12 000 r/min 離心2 min。將吸附柱CP3 置于離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50 ～100 μL 洗脫緩沖液EB，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL Primer 1（10 μmol/L）、0.4 μL Primer 2(10 μmol/L)、2 μL Template DNA、7.2 μL ddH2O，反應(yīng)體系總體積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

1）引物特異性檢測。選取擬枝孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和三線鐮刀菌等自沙棘枝條和根際土壤分離的真菌DNA 作為模板，用ddH2O 作為陰性對照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測引物的特異性。

2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏性檢測。將提取的擬枝孢鐮刀菌的DNA 進(jìn)行梯度稀釋，使每微升模板的拷貝數(shù)為103～108。以梯度稀釋質(zhì)粒DNA作為模板，以ddH2O 作為陰性對照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的靈敏性。由儀器內(nèi)置程序繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為樣品拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

N=(C×6.02×1023)/[(L+L′)×660]。

式中：N為每微升模板的質(zhì)?？截悢?shù)；C為質(zhì)粒體積濃度；L為載體長度；L′為片段長度。

3）枝條和土壤樣品檢測。將所提取的枝條和土壤微生物基因組DNA 樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒的構(gòu)建

將構(gòu)建好的擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性引物（QS-2F、QS-2R）進(jìn)行菌落PCR，使用1.4%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。由圖1 可見，陽性菌落條帶明顯，泳道4（CK）無條帶。將測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)同源性高達(dá)100%，說明EF-1a質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specific detection result of F.sporotrichioides EF-1α fragment plasmid

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物的特異性

PCR 引物特異性檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2 可見，所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性引物（QS-2F、QS-2R）以擬枝孢鐮刀菌為DNA 模板能進(jìn)行有效擴(kuò)增，且PCR 呈陽性反應(yīng)，其他供試菌株的DNA 模板及陰性對照均未檢測到條帶，證明該引物對擬枝孢鐮刀菌具有較高的特異性。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物特異性的電泳檢測結(jié)果Fig.2 PCR primer specific detection

2.3 擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的靈敏性

提取擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒DNA 后，分別稀釋成不同質(zhì)粒DNA 模板濃度，使每微升模板的拷貝數(shù)為103～108，進(jìn)行擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增（圖3）和常規(guī)PCR 擴(kuò)增。

圖3 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification result of quantitative real-time PCR for F.sporotrichioides EF-1α fragment plasmid

擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。由圖4 可見，反應(yīng)循環(huán)數(shù)和DNA 濃度的對數(shù)呈現(xiàn)線性關(guān)系。

圖4 擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of quantitative real-time PCR for F.sporotrichioides

應(yīng)用常規(guī)PCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖5所示。由圖5 可見，以質(zhì)粒作為模板且每微升的拷貝數(shù)為108～104時(shí)，有明顯條帶；在每微升的拷貝數(shù)為103時(shí)，能觀察到微弱條帶；在每微升的拷貝數(shù)為102、10 時(shí)及陰性對照中均未檢測到條帶。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增時(shí)，能夠有效檢測每微升的拷貝數(shù)為103。表明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的靈敏性優(yōu)于常規(guī)PCR。

圖5 普通PCR 檢測不同濃度擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質(zhì)粒DNA 的電泳結(jié)果Fig.5 The electrophoresis diagram of ordinary PCR for different concentrations of plasmid DNA of F.sporotrichioides

2.4 枝條和土壤DNA 樣品的擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量檢測

將枝條和土壤DNA 樣品進(jìn)行擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明在25 份枝條樣品中有6 份存在擬枝孢鐮刀菌，在12 份土壤樣品中有1 份存在擬枝孢鐮刀菌。將檢測結(jié)果代入擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖6所示。由圖6 可見：每微升所提取枝條DNA樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為103.75～104.15，即每克枝條樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為6×104.75～6×105.15；每微升所提取GSGD 土壤DNA 樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)是103.82，即每克土壤樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為6×104.82。

圖6 枝條和土壤樣品中擬枝孢鐮刀菌數(shù)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量檢測結(jié)果Fig.6 Quantitative real-time PCR quantitative detection of the expression of F.sporotrichioides in branches and soil

3 結(jié)論與討論

沙棘枝枯病是由擬枝孢鐮刀菌引起的系統(tǒng)性病害，有必要建立一套有效的擬枝孢鐮刀菌檢測體系進(jìn)行沙棘枝枯病的早期防控。本研究中通過設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化了一種精準(zhǔn)檢測沙棘枝枯病的方法—擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。本研究中所用引物是基于翻譯延伸因子（EF-1α）設(shè)計(jì)的[22]，可以特異性擴(kuò)增擬枝孢鐮刀菌，能夠較好地區(qū)分?jǐn)M枝孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌以及其他多種致病菌，同時(shí)能夠定性定量檢測沙棘枝干和土壤的病原菌密度。本研究中建立了擬枝孢鐮刀菌質(zhì)粒檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用該曲線得到的每微升DNA 樣本的檢測拷貝數(shù)是103～108。通過對21 份枝條和土壤樣品進(jìn)行檢測，在7份樣品中發(fā)現(xiàn)熒光信號，進(jìn)一步證明了該方法的實(shí)用性和可操作性。

本研究中采用的擬枝孢鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法可替代傳統(tǒng)的稀釋平板計(jì)數(shù)法，具有易操作、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，該方法有利于研究病原菌在沙棘植物組織和土壤中的分布。

目前，常規(guī)PCR 已被應(yīng)用于生態(tài)監(jiān)測、植物病害診斷和病原物鑒定等方面[18]，但是該方法僅適用于植物枝干和土壤內(nèi)含病原菌的鑒定，不能進(jìn)行定量檢測[8]。土壤中病原菌的傳統(tǒng)檢測方法操作復(fù)雜、靈敏度低且檢測時(shí)間長[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)既有常規(guī)PCR 擴(kuò)增的高靈敏性，且兼?zhèn)銬NA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR 檢測的缺點(diǎn)，又不會對環(huán)境造成污染[23]。該技術(shù)的采用大大降低了對植物枝干、空氣及土壤中病原菌的定性和定量檢測難度。例如，該技術(shù)在小麥葉片中條銹病菌和白粉病菌的檢測[24-25]及水稻種子中惡苗病菌的定量檢測[26]中均得到了較好應(yīng)用[27]。本研究中僅針對甘肅地區(qū)沙棘枝枯病樣品的病原菌擬枝孢鐮刀菌進(jìn)行了定量檢測，還應(yīng)使用其他地區(qū)的樣品對該檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。