熊 穎，禹 霖，柏文富，聶東伶，李建揮，嚴(yán)佳文，吳思政

（1.湖南省植物園 經(jīng)濟植物研究所，湖南 長沙 410116；2.湖南省藍莓研究發(fā)展中心，湖南 長沙 410116）

花青素為黃酮類化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)[1]，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、保護視力[4-5]、抗癌[6-7]、抑菌[8]、調(diào)節(jié)腸道菌群[9]等功效。因此，花青素在食品、化妝品、藥品等工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用范圍較廣。藍莓因花青素含量高、食用價值高而受到廣泛關(guān)注。藍莓不僅是一種理想的鮮食水果，還可被加工成各種休閑食品，具有較高的經(jīng)濟價值和廣闊的發(fā)展前景。

目前，國內(nèi)外對藍莓果實的研究主要集中在不同品種的加工特性、采后保鮮、抗氧化的對比以及相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)等方面[10-13]。我國藍莓種植面積廣，藍莓深加工發(fā)展迅速，但加工過程中產(chǎn)生的下腳料利用程度有限，有研究結(jié)果表明藍莓果酒或果汁生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的酒渣或果渣中仍殘留大量花青素[14-15]。目前，關(guān)于藍莓果渣高效利用的研究報道較多，但關(guān)于藍莓酒渣高效利用的研究報道較為鮮見[16-18]。藍莓酒渣若不能得到充分利用會造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。為充分利用藍莓資源，提高藍莓花青素的利用效率，對藍莓酒渣中花青素進行高效提取和利用勢在必行。

本研究中以藍莓酒渣為原料，使用乙醇-檸檬酸提取花青素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對藍莓酒渣花青素的提取工藝進行優(yōu)化，并使用高效液相色譜儀對藍莓酒渣中的花青素組成進行分析，旨在完善藍莓酒渣花青素高效提取工藝，為藍莓酒渣的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藍莓鮮果為采自湖南省植物園藍莓園的‘燦爛’藍莓，藍莓酒渣為‘燦爛’藍莓鮮果經(jīng)純釀后的下腳料。無水乙醇、KCl、醋酸鈉、HCl、檸檬酸等均為分析純，產(chǎn)自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲酸、乙腈均為色譜純，產(chǎn)自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070A 恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于中國上海一恒公司，HJ-4A 恒溫磁力攪拌器購于江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠，WF-04B 粉碎機購于永康市偉峰電器廠，UV1200 紫外可見光分光光度計購于上海美譜達儀器公司，Centrifuge 5418 離心機購于德國Eppendorf 公司，1260 型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）購于美國Agilent 公司，Agile ZORBAX SB-C18 分析型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）購于美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素提取

藍莓酒渣經(jīng)自然干燥后，用粉碎機粉碎，過80 目篩，用石油醚脫脂后，于45 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，將烘干后的藍莓酒渣粉密封保存于4 ℃冰箱內(nèi)。配制體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%的酒精水溶液，并用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH 至2、3、4、5、6，密封備用。

稱取(1.00±0.01)g 藍莓酒渣粉，分別與10、15、20、25、30 mL 不同體積分?jǐn)?shù)的酒精水溶液混合均勻，然后在30、40、50、60、70 ℃條件下攪拌提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，將混合物于4 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液，并用對應(yīng)溶劑定容至溶劑的初始體積得提取液。分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時長和溶劑pH 對藍莓酒渣花青素提取的影響。

1.3.2 總花青素含量測定

參照文獻[19]采用pH 示差法并稍加調(diào)整，測定提取液總花青素含量。分別取0.1 mL 提取液于2個試管中。向其中1 支試管中加入4.9 mL的KCl-HCl 緩沖液（pH=1），搖勻后避光靜置50 min，分別測定待測液在510 nm 波長處的吸光度（A510），在700 nm 波長處的吸光度（A700）。向另1 支試管中加入4.9 mL 的NaAc-HCl 緩沖液（pH=4.5），搖勻后避光靜置50 min，分別測定待測液在510 nm 波長處的吸光度（A510′），在700 nm 波長處的吸光度（A700′）。

花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）以藍莓酒渣中矢車菊-3-O-葡萄糖苷當(dāng)量表示，計算公式為

式中：M為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量449.2 g/mol；D為稀釋倍數(shù)50；V為提取液體積；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù)26 900；L為光程1 cm；m為藍莓酒渣質(zhì)量1 g。

1.3.3 花青素組成分析

參照文獻[14]中所述方法分析花青素組成。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2019 和SPSS 22 軟件進行計算和分析，單因素結(jié)果均使用Origin 2018軟件繪圖，使用Design-Expert 8.0.5 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓酒渣花青素提取單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍莓酒渣花青素提取效率的影響如圖1所示。從圖1 可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍莓酒渣花青素的提取效率有較大影響，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液對藍莓酒渣花青素有較好的提取效果，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加或降低時花青素提取效率均出現(xiàn)了不同程度降低。這是因為花青素屬于黃酮類化合物，分子極性較強，易溶于極性與之類似的溶劑，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的極性不同，當(dāng)乙醇溶液極性與花青素極性相近時，花青素提取效率較高。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下藍莓酒渣花青素的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different ethanol volume fractions

2.1.2 提取溫度對提取效率的影響

提取溫度對藍莓酒渣花青素提取效率的影響如圖2所示。從圖2 可以看出，藍莓酒渣花青素提取效率隨溫度升高呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，當(dāng)提取溫度由30 ℃升至50 ℃時，由于分子運動加快，花青素向溶劑擴散的速度加快，因此提取效率有所提高，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時花青素發(fā)生熱分解而導(dǎo)致提取效率下降，尤其是當(dāng)溫度超過70 ℃時提取效率下降明顯，因此藍莓酒渣花青素提取的最佳溫度為50 ℃。

圖2 不同提取溫度條件下藍莓酒渣花青素的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different extraction temperature

2.1.3 料液比對提取效率的影響

料液比對藍莓酒渣花青素提取效率的影響如圖3所示。從圖3 可以看出，在一定范圍內(nèi)，藍莓酒渣花青素提取效率隨著溶劑比例的增多而升高，當(dāng)料液比為1∶20 時提取效率達到最高，隨溶劑比例繼續(xù)增加，提取效率出現(xiàn)了顯著下降，因此藍莓酒渣花青素提取的最佳料液比為1∶20。

圖3 不同料液比條件下藍莓酒渣花青素的提取效率Fig.3 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different solid-liquid ratios

2.1.4 溶劑pH 對提取效率的影響

溶劑pH 對藍莓酒渣花青素提取效率的影響如圖4所示。從圖4 可以看出，溶劑pH 較低時更有利于藍莓酒渣花青素的提取，當(dāng)溶劑pH 為2 或3 時，藍莓酒渣花青素提取效率無顯著差異，但當(dāng)pH 為4時，藍莓酒渣花青素提取效率出現(xiàn)顯著降低，因此藍莓酒渣花青素提取的最佳溶劑pH 為2 或3。

圖4 不同溶劑pH 條件下藍莓酒渣花青素的提取效率Fig.4 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different solvent pH

2.1.5 提取時長對提取效率的影響

提取時長對藍莓酒渣花青素提取效率的影響如圖5所示。從圖5 可以看出，藍莓酒渣花青素提取效率隨提取時長的延長出現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)提取時長為1.5 h 時花青素提取效率出現(xiàn)最高點。這是因為花青素提取的動力主要來源于物料與溶劑中花青素的濃度差，提取時長較長時花青素的溶解更充分，花青素提取效率更高，但隨著提取時長繼續(xù)延長花青素發(fā)生降解，從而導(dǎo)致提取效率有所降低。

圖5 不同提取時長條件下藍莓酒渣花青素的提取效率Fig.5 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different extraction duration

2.2 藍莓酒渣花青素提取響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時長和溶劑pH 共5個因素，進行5 因素3 水平Box-Behnken 響應(yīng)面中心組合設(shè)計試驗，因素和水平編碼見表1。

在該“囚徒困境”式的博弈[12]中，港口城市可采取的最優(yōu)投資策略是：不會考慮競爭者的投資，認為投資越多越好，直到投資到自身投資的上限。另外一種做法是，在沒有滿足自身投資準(zhǔn)則時不投資。此時，港口城市可選擇的戰(zhàn)略不投資港口、以最大能力投資港口、在口投資回報率等于城市平均投資回報率之前投資港口等3種。

表1 藍莓酒渣花青素提取Box-Behnken 響應(yīng)面試驗因素及其水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface test for anthocyanin extraction from blueberry lees

2.2.2 建模及方差分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。對表2 中藍莓酒渣花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）和5個因素進行分析，得到花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和各因素的多元回歸方程：

表2 藍莓酒渣花青素提取Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Box-behnken response surface experiment results of anthocyanin extraction from blueberry lees

ω=5.72+0.12A-0.15B+0.27C-0.087D-0.18E-0.040AB+0.14AC+0.012AD-0.12AE+0.062BC+0.060BD-0.15BE+0.17CD-0.058CE+0.28DE-0.16A2-0.50B2-1.98C2+0.051D2-0.018 7E2。

式中：A為溶劑體積分?jǐn)?shù)；B為提取溫度；C為料液比；D為溶劑pH；E為提取時長。

Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析結(jié)果見表3。由表3 可知，B、C、E、DE（溶劑pH 與提取時長的交互作用）、B2和C2對藍莓酒渣花青素的提取效率有顯著影響。從F值來看，各提取參數(shù)對藍莓酒渣花青素提取效率的影響程度由強到弱依次為料液比、提取時長、提取溫度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、溶劑pH。模型F值為33.53，且P值小于0.05，說明用該模型模擬各參數(shù)對藍莓酒渣花青素提取效率的影響是可靠的。除此之外，該模型失擬項F值為3.18（＞0.05），說明失擬項相對于純誤差不顯著，該多元回歸方程對試驗結(jié)果的擬合效果較好。

表3 藍莓酒渣花青素提取Box-behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析結(jié)果?Table 3 Variance analysis of Box-behnken response surface test results for anthocyanin extraction from blueberry lees

2.2.3 交互作用分析與工藝優(yōu)化

對5個因素之間的交互作用進行分析，得出以提取液中花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值的響應(yīng)面，如圖6所示。從圖6 可以看出，其他因素不變時乙醇體積分?jǐn)?shù)升高會在一定程度上提高花青素的提取效率，提取液中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會隨提取溫度升高出現(xiàn)先升、后降的趨勢，料液比對提取液中花青素的含量有較大影響，其他因素不變時溶劑pH 對提取液中花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不大，其他因素不變時提取時長對提取液中花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較小。在各因素的交互作用下均存在最大響應(yīng)值，說明各因素均存在最適值，以試驗值最低點為出發(fā)點，以響應(yīng)值為最大值進行優(yōu)化，最終得到藍莓酒渣花青素提取的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50 ℃、料液比1∶20、溶劑pH=2、提取時長1 h，該條件下提取液中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達6.38 mg/g。

圖6 藍莓酒渣花青素提取效率對因素交互作用的響應(yīng)面Fig.6 Response diagram of the interaction of factors on the extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees

2.2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果驗證

經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化后，藍莓酒渣花青素提取的最佳工藝條件確定為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、乙醇溶液pH=2、提取溫度50 ℃、提取時長1 h，在此條件下藍莓酒渣花青素提取液中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.38 mg/g。為了驗證經(jīng)優(yōu)化后藍莓酒渣花青素提取工藝的可靠性，在此工藝條件下進行3 次提取試驗，藍莓酒渣花青素提取液中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(6.17±0.02)mg/g，與理論值6.38 mg/g 基本吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 藍莓酒渣花青素組成分析

藍莓酒渣、鮮果和3 種花青素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜分析結(jié)果如圖7所示。從圖7 可以看出，3 種標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序依次為飛燕草色素（10.396 min）、矢車菊色素（13.091 min）、錦葵色素（17.333 min），對照標(biāo)準(zhǔn)品可知藍莓酒渣提取液中共有2 種花青素，分別為飛燕草色素和錦葵色素，藍莓鮮果中除了含有3 種有標(biāo)樣的花青素之外還含有1 種無標(biāo)樣的花青素，根據(jù)文獻報道推測該花青素可能為矮牽牛色素[14]。

圖7 藍莓酒渣和鮮果花青素提取液及花青素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜分析結(jié)果Fig.7 HPLC analysis of extracts from blueberry lees and fresh fruits and standard anthocyanins

藍莓發(fā)酵前后花青素組成和含量變化較明顯。其中，藍莓酒渣中所含2 種花青素燕草色素和錦葵色素的相對含量分別為70.48%和29.52%，藍莓鮮果中飛燕草色素、矢車菊色素、無標(biāo)樣物質(zhì)和錦葵色素的相對含量分別為16.92%、11.08%、16.83%和55.17%。發(fā)酵后，藍莓中飛燕草色素的峰面積由82.3 變?yōu)?8.3，變化較??；矢車菊色素和無標(biāo)樣物質(zhì)峰面積分別由53.9 和81.9 變?yōu)?，變化明顯；錦葵色素峰面積由268.4 變?yōu)?2.8，變化較大。由此可見，藍莓經(jīng)過發(fā)酵后4 種花青素的含量均有不同程度減少，其中矢車菊色素、無標(biāo)樣物質(zhì)和錦葵色素減少程度最大，飛燕草色素減少程度最低。

3 結(jié)論與討論

本研究中使用檸檬酸酸化的乙醇溶液提取藍莓酒渣中的花青素，經(jīng)采用響應(yīng)面法優(yōu)化后確定了最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50℃、料液比1∶20、溶劑pH 為2、提取時長1 h。驗證試驗結(jié)果顯示，在該提取條件下，提取液中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(6.17±0.02)mg/g，與預(yù)測值6.38 mg/g 僅相差3.29%，表明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。藍莓發(fā)酵后，所含花青素種類和含量均有較大的變化，‘燦爛’藍莓鮮果中主要含有飛燕草色素、矢車菊色素、錦葵色素和一種未知色素，4 種色素的相對含量分別為16.92%、11.08%、55.17%和16.83%，藍莓酒渣中僅含有飛燕草色素（70.47%）和錦葵色素（29.53%）。

乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑pH、提取溫度、料液比和提取時長均對藍莓酒渣花青素的提取效率有較大的影響。單因素試驗結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時藍莓酒渣花青素提取效果較好。前人的研究結(jié)果也表明：乙醇濃度對花青素的提取效率有較大影響，藍莓花青素提取較理想的乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%[15,20]；在花青素提取過程中溶劑pH 越低，花青素提取效果越好，這可能與花青素在酸性條件下更穩(wěn)定有關(guān)[21-22]。李亮等[23]和張盼盼等[24]的研究結(jié)果表明，溶劑pH 為2 或3 時有更高的花青素提取效率，胡敏等[25]的研究結(jié)果也表明當(dāng)溶劑pH 為2 時更有利于花青素的提取和保存。提取時長對花青素提取效率有顯著影響，提取時長過短則花青素溶出不充分，提取時長過長會導(dǎo)致花青素嚴(yán)重分解，前人的研究結(jié)果也說明了這一現(xiàn)象[26-27]。在本研究中提取時長為1.5 h 時，既能保證花青素充分溶出，又能保證花青素分解程度較低，因此1.5 h 是較理想的提取時長?；ㄇ嗨鼐哂袩岱纸獾奶攸c，且其分解過程為一級反應(yīng)動力學(xué)過程[28-29]，因此提取溫度不宜過高，但是在實際操作中往往會根據(jù)試驗材料中花青素溶出的難易程度調(diào)整提取溫度[30]。藍莓酒渣花青素溶出速度較快，本研究中得出的最佳提取溫度與楊玉等[31]的研究結(jié)果較接近。在提取過程中，料液比是決定提取效率的重要因素之一，料液比過低導(dǎo)致提取達到平衡的時長過短，目標(biāo)成分溶解不充分，料液比過高則會導(dǎo)致溶劑的浪費，因此在提取過程中選擇合適的料液比是至關(guān)重要的。料液比對藍莓加工殘渣中花青素的提取有較大的影響，在本研究中得出的藍莓酒渣花青素提取的最佳料液比為1∶20，與田建華等[32]的研究結(jié)果類似。響應(yīng)面試驗結(jié)果表明，藍莓酒渣花青素的提取效率不僅取決于各因素，還在一定程度上取決于各因素之間的交互作用，其中溶劑pH 與提取時長的交互作用對花青素提取效率的影響最顯著，與張盼盼等[24]的研究結(jié)果存在一定差異，這可能是原材料、提取方式等不同導(dǎo)致的。

藍莓在發(fā)酵后4 種花青素的含量均有不同程度減少，其中錦葵色素含量變化較大，矢車菊色素和未知色素含量變化明顯，飛燕草色素含量變化較微弱，藍莓酒渣中僅檢測出2 種花青素，其中飛燕草色素相對含量為70.48%，錦葵色素相對含量為29.52%。宋頎等[33]和Wu 等[34]的研究結(jié)果表明，藍莓酒渣中錦葵色素是含量最高的花青素，與本研究結(jié)果有一定差異，這可能是因為藍莓品種和發(fā)酵條件存在差別，丁原春等[35]的研究結(jié)果表明藍莓在發(fā)酵過程中花青素含量的變化受發(fā)酵工藝的影響較大。

由于受發(fā)酵條件影響，藍莓酒渣中殘留的花青素種類和含量有較大差異，而本研究中僅考慮了在實驗室條件下藍莓酒渣中花青素的組成，應(yīng)進一步探索工業(yè)化生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的藍莓酒渣中花青素的高值化利用，因此下階段將圍繞花青素的精制、各種花青素的分離提純、各種花青素之間的協(xié)同規(guī)律以及花青素在功能性食品加工過程中的應(yīng)用等方面開展研究。