胡日查，李偉程，呂瑞瑞，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，L.helveticus）是一種專(zhuān)性同型發(fā)酵乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB），因高蛋白水解活性而被廣泛用于奶酪、發(fā)酵乳飲料等的生產(chǎn)，是開(kāi)發(fā)功能性發(fā)酵乳制品的優(yōu)良菌種[1]。瑞士乳桿菌本身具有一定益生特性，其發(fā)酵生產(chǎn)的乳制品含有豐富的生物活性肽，在提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)賦予產(chǎn)品緩解高血壓、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等益生功能[2]。

隨著第2 代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序所需的物質(zhì)和時(shí)間成本大大降低，使得大規(guī)模微生物基因組測(cè)序成為可能[3]。比較基因組學(xué)（Comparative genomics） 以不同物種或同一物種的不同個(gè)體的全基因組序列相似性為基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)基因數(shù)量、功能及其表達(dá)機(jī)制[4]。通過(guò)比較基因組學(xué)可識(shí)別物種的保守基因和差異基因，進(jìn)而討論其遺傳背景和表型演化[3，5]，而全基因組完成圖可提供更全面的基因組信息，有利于準(zhǔn)確比較基因組分析[6]。瑞士乳桿菌作為重要的發(fā)酵劑菌種，利用比較基因組學(xué)方法解析其基因組信息，對(duì)開(kāi)發(fā)其工業(yè)生產(chǎn)潛力至關(guān)重要。

瑞士乳桿菌H9 和H10 是本團(tuán)隊(duì)分別從中國(guó)西藏發(fā)酵牦牛乳和傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離的瑞士乳桿菌菌株。瑞士乳桿菌H9 蛋白水解活性高，其發(fā)酵乳制品中含有VPP、IPP 等生物活性肽，而瑞士乳桿菌H10 同樣具有高蛋白水解活性，然而其發(fā)酵乳不產(chǎn)生上述寡肽[7]。本團(tuán)隊(duì)已完成對(duì)瑞士乳桿菌H9 和H10 的全基因組測(cè)序[8-9]。本研究以瑞士乳桿菌H9 和H10 基因組及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中其它16株瑞士乳桿菌基因組完成圖為研究對(duì)象，利用比較基因組學(xué)方法從基因組層面探究不同瑞士乳桿菌菌株間的遺傳差異，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 瑞士乳桿菌基因組序列

本研究所用18 株瑞士乳桿菌全基因組完成圖均來(lái)自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=lactobacillus%20helveticus），詳情見(jiàn)表1。

1.2 平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）的計(jì)算

本研究參考Goris 等[10]報(bào)道的方法，計(jì)算18株瑞士乳桿菌基因組序列的ANI 值。

1.3 基因預(yù)測(cè)與注釋

利用Prokka（v1.14）[11]軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得基因功能注釋信息。

1.4 泛-核心基因集的構(gòu)建（Pan-core genome）

采用Roary（v3.13.0）[12]軟件以氨基酸序列相似性大于90%的標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別核心基因集（Core genes）和特有基因，其中核心基因?yàn)樗芯旯灿谢?，特有基因指只存在? 個(gè)菌株的基因。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

基于核心基因核苷酸序列，采用FastTree（2.1.3）[13]軟件通過(guò)最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用iTol 軟件（http：//https：//itol.embl.de/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行展示。

1.6 共線(xiàn)性分析

使用 Mauve （v20150226）軟件[14]對(duì)瑞士乳桿菌H9、瑞士乳桿菌H10 和瑞士乳桿菌DPC4571 的基因組序列進(jìn)行共線(xiàn)性分析。

1.7 數(shù)據(jù)作圖

使用R（V3.5.0）軟件中的“pheatmap”程序包繪制熱圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 瑞士乳桿菌H9 和H10 基因組基本特征

通過(guò)Prokka 軟件注釋獲得瑞士乳桿菌H9 和H10 及其它瑞士乳桿菌菌株基因組特征 （表1）。瑞士乳桿菌H9 基因組大小1.87 Mb，不含質(zhì)粒，GC（%）含量為37.02%，預(yù)測(cè)到2 015 個(gè)編碼序列（Coding sequence，CDS），12 個(gè)rRNA 和61 個(gè)tRNA（表1）；瑞士乳桿菌H10 基因組由1 條染色體和1 個(gè)質(zhì)粒組成，全基因組大小為2.17 Mb，其中環(huán)狀染色體大小為2.15 Mb，GC（%）含量為36.79%，預(yù)測(cè)到2 237 個(gè)CDS，63 個(gè)tRNA。

乳酸菌在適應(yīng)其富營(yíng)養(yǎng)生存環(huán)境過(guò)程中，缺失多種合成代謝途徑，其基因組趨于縮小[15]，瑞士乳桿菌基因組也正經(jīng)歷衰減[16]。所以推測(cè)瑞士乳桿菌H9 基因組較小可能與其對(duì)乳環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析是研究種群結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化的重要方法，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可直觀地表現(xiàn)同一群體不同個(gè)體間的遺傳距離與進(jìn)化關(guān)系[17]。為了解瑞士乳桿菌H9 和H10 與其它瑞士乳桿菌菌株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本研究以近源物種母雞乳桿菌（Lactobacillus gallinarum）HFD4 作為外群，基于核心基因的核苷酸序列，通過(guò)最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

結(jié)果顯示（圖1），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可分為4 個(gè)分支，瑞士乳桿菌H9 在距離外群菌株最遠(yuǎn)的分支IV，該分支內(nèi)的全部7 個(gè)菌株均為發(fā)酵乳制品分離株，其中包括工業(yè)發(fā)酵劑菌株瑞士乳桿菌CNRZ32；瑞士乳桿菌H10 和CUAH18 聚類(lèi)于分支II，該分支離外群菌株最近；4 個(gè)分支中人類(lèi)腸道/糞便分離株和發(fā)酵乳制品分離株呈混合聚類(lèi)，如除瑞士乳桿菌H10、CUAH18 和R0052 外，其它乳制品分離株均聚類(lèi)于分支III 和分支IV，而3 株俄羅斯人類(lèi)腸道分離株聚類(lèi)于分支III 中的一個(gè)亞分支，發(fā)酵乳制品分離株ROO52 與2 株韓國(guó)人類(lèi)糞便分離株聚類(lèi)于分支I。王曉偉[18]基于245 株瑞士乳桿菌11 個(gè)持家基因序列型利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，其聚類(lèi)結(jié)果與菌株分離地最小生成樹(shù)一致。關(guān)于分離地與分離源對(duì)瑞士乳桿菌進(jìn)化的影響有待進(jìn)一步研究。

圖1 基于核心基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on core gene sequences

2.3 平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）分析

平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）是用以評(píng)估遺傳多樣性的常用方法。該方法通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行同源序列比對(duì)來(lái)判斷菌株是否為同一個(gè)種或亞種[19]。在比較基因組學(xué)分析中，ANI 可評(píng)估基因組間的多態(tài)性和相似性，一般認(rèn)為ANI 大于95%為同一個(gè)種[20]。Zhong 等[21]通過(guò)計(jì)算兩兩序列之間的ANI 值發(fā)現(xiàn)161 株糞腸球菌不同菌株之間存在遺傳差異。本研究計(jì)算18 株瑞士乳桿菌基因組完成圖（表1）兩兩之間ANI 值，并繪制熱圖。

號(hào)編NCBI地離分GCA_001308285.1疆新國(guó)中GCA_000422165.1-GCA_001746265.1斯羅俄GCA_001702095.1斯羅俄GCA_000015385.1-GCA_002849955.1士瑞GCA_002849935.1士瑞GCA_002849915.1士瑞GCA_000189515.1藏西國(guó)中GCA_000525715.1藏西國(guó)中GCA_004114755.1國(guó)韓GCA_000961015.1疆新國(guó)中GCA_003955865.1國(guó)韓GCA_003610975.1亞利加保GCA_009498395.1藏西國(guó)中GCA_001006025.1疆新國(guó)中GCA_902386585.1斯羅俄GCA_000165775.1大拿加息信本基組因基的菌桿乳士瑞1表General information of Lactobacillus helveticus genomes源離分tRNA rRNA量數(shù)CDS GC/%奶馬酸64 15 2 235 36.81酪奶64 12 2 407 36.93道腸童兒康健64 15 2 187 37.03道腸童兒康健64 15 2 192 37.04酪奶61 12 2 199 37.08清乳63 12 2 305 37.06酪奶62 12 2 395 37.03品制乳63 12 2 214 36.95乳酵發(fā)統(tǒng)傳63 12 2 265 36.79奶牛牦酸61 12 2 015 37.02便糞兒嬰63 12 2 185 36.83乳酵發(fā)61 12 2 255 36.88便糞類(lèi)人63 12 2 193 36.82乳酵發(fā)60 12 2 271 37.09奶酸63 12 2 326 36.92乳酵發(fā)63 12 2 337 36.93道腸類(lèi)人64 15 2 192 37.04乳酵發(fā)61 12 2 288 36.80 Table 1 /Mb小大組2.16 2.23 2.05 2.06 2.08 2.20 2.26 2.05 2.17 1.87 2.16 2.11 2.16 2.08 2.08 2.08 2.06 2.13因基量數(shù)Scaffolds稱(chēng)名株菌1 CAUH18 1 CNRZ32 1 D75 1 D76 1 DPC 4571 2 FAM22155 2 FAM8105 2 FAM8627 2 H10 1 H9 2 IDCC3801 2 KLDS1.8701 3 LH5 1 LH99 1 LZ-R-5 1 MB2-1 1 MGYG-HGUT-02384 1 R0052

結(jié)果如圖2所示，18 株瑞士乳桿菌基因組之間ANI 均大于97.25%，平均ANI 值為98.52%。根據(jù)ANI 值分布，18 株瑞士乳桿菌可分為4 個(gè)類(lèi)群，即類(lèi)群I、類(lèi)群II、類(lèi)群III 和類(lèi)群IV，瑞士乳桿菌H9 和H10 分別屬于類(lèi)群III 和類(lèi)群I，聚類(lèi)結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本一致；瑞士乳桿菌H9 與H10 間的ANI 值為98.02%，瑞士乳桿菌H9 與包括工業(yè)發(fā)酵劑菌株瑞士乳桿菌CNRZ32 在內(nèi)的9株發(fā)酵乳制品分離株之間平均ANI 值為99.01%，瑞士乳桿菌H10 與CAUH18 之間的ANI 值最高（99.48%），與其它菌株之間的ANI 值均較低（平均97.99%）；人類(lèi)腸道和糞便分離株類(lèi)群（類(lèi)群II和類(lèi)群IV）內(nèi)部菌株間ANI 值極高（平均99.99%），而乳制品分離株類(lèi)群（類(lèi)群I 和類(lèi)群III）內(nèi)部菌株間ANI 值較低（平均98.50%），表明瑞士乳桿菌發(fā)酵乳制品分離株的基因組序列一致性比人類(lèi)腸道/糞便分離株低，推測(cè)瑞士乳桿菌基因組序列多樣性可能與其分離源有關(guān)。

圖2 18 株瑞士乳桿菌的ANI 值熱圖Fig.2 Heatmap of ANI based on the genome sequences of 18 L.helveticus

2.4 共線(xiàn)性分析

共線(xiàn)性分析可通過(guò)檢測(cè)不同物種間或同一物種不同個(gè)體基因組間同源序列及其排列順序的一致性來(lái)研究基因組間的相關(guān)性，基因組相關(guān)性越高則其中同源序列一致性越高[22]。瑞士乳桿菌DPC4571 分離自干酪，并于2008年完成全基因組測(cè)序，是第1 株完成全基因組測(cè)序的瑞士乳桿菌菌株[23]。本研究以瑞士乳桿菌DPC4571 菌株基因組序列作為參考，利用Mauve 軟件對(duì)瑞士乳桿菌H9 和H10 基因組進(jìn)行共線(xiàn)性分析。

結(jié)果如圖3所示，與瑞士乳桿菌DPC4571 比較，瑞士乳桿菌H10 有976 kb 的大片段倒置，而瑞士乳桿菌H9 基因組只存在局部倒置，其中主要含有cpoA （α-半乳糖基葡萄糖基二?；视秃厦福?、ItaS1（脂磷壁酸合酶1）等與細(xì)胞膜、細(xì)胞壁合成及tRNA 和rnr（核糖核酸酶R）等tRNA 修飾相關(guān)基因。瑞士乳桿菌H9 基因組中有2 處約17 kb 左右片段缺失，其中主要含有bbmA（糖基水解酶）、cysE（絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶）、ymdB（O-乙酰基-ADP-核糖脫乙酰酶）等涉及多糖、氨基酸及能量代謝等過(guò)程相關(guān)基因；瑞士乳桿菌H9 基因組有一處約10 kb 的特有片段，其中主要含有msrB（肽蛋氨酸亞砜還原酶）和deoD（嘌呤核苷磷酸化酶）等與蛋白質(zhì)和核酸的修飾相關(guān)基因；瑞士乳桿菌H10 有一處35.36 kb 特有片段，包含sasA（自適應(yīng)感應(yīng)激酶）、pepDA（二肽酶A）等基因，主要與環(huán)境感應(yīng)和蛋白水解等過(guò)程相關(guān)。

圖3 瑞士乳桿菌基因組序列共線(xiàn)性分析Fig.3 Synteny analysis of L.helveticus genomic sequences

基因片段插入和缺失是LAB 進(jìn)化過(guò)程中的常見(jiàn)現(xiàn)象。LAB 菌株在適應(yīng)其富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境過(guò)程中，通過(guò)基因插入和缺失等事件丟失非必須基因和功能，同時(shí)以同源重組和水平基因轉(zhuǎn)移等途徑獲得有利于其適應(yīng)生存環(huán)境的功能基因[15，24]。兩株瑞士乳桿菌均有一定的基因片段插入或缺失現(xiàn)象發(fā)生，提示菌株在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了基因重組和水平基因轉(zhuǎn)移等事件[25]。

2.5 泛-核心基因集（Pan-core genome）的構(gòu)建及菌株特有功能基因分析

為比較不同菌株所含基因差異，利用Roary軟件構(gòu)建泛-核心基因集。18 株瑞士乳桿菌的泛基因集包括5 792 個(gè)基因，其中核心基因1 107個(gè)，特有基因1 527 個(gè)。

由圖4可知，隨著基因組數(shù)量的增加，核心基因個(gè)數(shù)逐漸減少，且趨于穩(wěn)定，泛基因個(gè)數(shù)持續(xù)增加，表明瑞士乳桿菌基因組具有開(kāi)放性，即隨著基因組數(shù)量的增加，仍有出現(xiàn)新基因的趨勢(shì)[26]。

圖4 泛-核心基因集變化趨勢(shì)圖Fig.4 The trend chart of the size of core-pan genes

在18 株瑞士乳桿菌的1 527 個(gè)特有基因中，除去假定蛋白和插入序列等單元，瑞士乳桿菌H9有5 個(gè)、瑞士乳桿菌H10 有22 個(gè)特有功能基因（表2）。瑞士乳桿菌H9 的特有功能基因主要涉及氨基酸合成（dapH）和能量代謝（dkgA）等途徑，其中dapH 有2 個(gè)拷貝；瑞士乳桿菌H10 的特有功能基因，主要參與氨基酸代謝（Csd、sufS、fbiB、pspA、sdhA）、能量代謝（Hpr、pox5、apbE、nfr1、nfr2）、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（lutP、lysP、ytrE）等途徑。將糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為乳酸是乳酸菌獲取能量的主要途徑[27]。瑞士乳桿菌在其適應(yīng)乳環(huán)境過(guò)程中丟失多種氨基酸的合成代謝途徑相關(guān)基因，依靠其蛋白水解系統(tǒng)降解乳蛋白獲取所需氨基酸[28]。瑞士乳桿菌H10 特有功能基因更多涉及能量代謝和氨基酸代謝，推測(cè)瑞士乳桿菌H9 的營(yíng)養(yǎng)缺陷相對(duì)更嚴(yán)重，瑞士乳桿菌H10 可能具有更強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，但需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

表2 瑞士乳桿菌H9 和H10 特有功能基因Table 2 The unique genes of L.helveticus H9 and L.helveticus H10

3 結(jié)論

本研究以瑞士乳桿菌H9 和H10 為例，結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中其它16 株瑞士乳桿菌全基因組完成圖，基于比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌不同菌株基因組大小、質(zhì)粒數(shù)量、CDSs、tRNA、rRNA數(shù)量均存在差異；瑞士乳桿菌H9 和H10 基因組大小、質(zhì)粒、CDSs、tRNA 數(shù)量和染色體結(jié)構(gòu)均有差異。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，瑞士乳桿菌H9 與工業(yè)發(fā)酵劑菌株瑞士乳桿菌CNRZ32 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更近，瑞士乳桿菌H10 更接近外群菌株；平均核苷酸一致性聚類(lèi)結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)大致相同，瑞士乳桿菌H9 和H10 聚類(lèi)于不同類(lèi)群，瑞士乳桿菌發(fā)酵乳制品分離株的基因組序列一致性低于人類(lèi)腸道/糞便分離株；與參考菌株瑞士乳桿菌DPC4571 相比，瑞士乳桿菌H9 和H10 均有不同程度的片段插入、缺失和倒置；瑞士乳桿菌H9 和H10 特有功能基因存在差異，瑞士乳桿菌H10 的特有功能基因更多涉及氨基酸和能量代謝。本文通過(guò)比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌不同菌株基因組之間存在遺傳差異，為后續(xù)對(duì)瑞士乳桿菌的研究和應(yīng)用奠定遺傳學(xué)基礎(chǔ)。