周 爽,王 琰,孫光強(qiáng),史永恒,王 川,王國全,李 敏,王 斌

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康，目前使用纖栓劑溶栓是臨床首選治療手段，但重建血流導(dǎo)致再灌注腦損傷，即腦缺血/再灌注損傷(Cerebral ischemic/reperfusion injury,CI/RI)，神經(jīng)保護(hù)治療則成為應(yīng)用前景。CI-RI是多種機(jī)制參與的一種復(fù)雜病理生理過程，研究表明，當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，炎癥反應(yīng)是引起腦缺血損傷后再灌注損傷的關(guān)鍵原因之一[1]。因此，通過改善炎癥損傷來減輕腦缺血損傷，并可調(diào)節(jié)炎性因子失衡[2]，研究引起損傷的炎癥反應(yīng)無論是對(duì)缺血性腦卒中還是對(duì)之后的CI/RI都有著重要意義。腦缺血損傷發(fā)生后花生四烯酸含量增加，5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase，5-LOX)作用花生四烯酸代謝衍生白三烯和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生，這類活性物質(zhì)將參與中風(fēng)后的病理生理過程，例如氧化應(yīng)激和炎癥，還可能促成細(xì)胞凋亡[3-4]。5-LOX與炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，5-LOX的過表達(dá)可能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生并導(dǎo)致CI/RI后神經(jīng)元損傷更為嚴(yán)重[5]。

小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia,MG)是腦內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，在CI/RI發(fā)生后的炎癥反應(yīng)中起重要作用[6]。在腦缺血損傷后期，由于MG被過度激活，激活后的MG表達(dá)產(chǎn)生趨化因子和炎性因子，炎性因子聚集在腦缺血損傷部位，進(jìn)一步加劇腦損傷[7]。隨著MG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的日益關(guān)注，5-LOX通路也被認(rèn)為參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)[8-9]，MG中5-LOX通路的下調(diào)有助于缺血性腦損傷的恢復(fù)，但研究5-LOX，其最大的特點(diǎn)是能夠在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞，是一種具有自我失活功能、無免疫反應(yīng)的高效基因傳遞工具。并且具有容納外源目的基因，可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)、隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發(fā)揮作用等優(yōu)點(diǎn)[10]。為根據(jù)慢病毒載體技術(shù)的進(jìn)展，提高效率和生物安全性的載體設(shè)計(jì)，進(jìn)一步研究5-LOX途徑在CI/RI中作用機(jī)制。通過建立5-LOX過表達(dá)氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)BV2細(xì)胞模型，研究5-LOX在腦缺血炎性損傷中神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒來源：BV2小鼠MG系購自CTCC。pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質(zhì)粒和293T細(xì)胞購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000 Reagent購自Invitrogen(美國)。

1.1.2 主要試劑與儀器:LB培養(yǎng)基(Sigma，美國)，B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(博大泰克，北京)，XL1-Blue，EB(Ethidium Bromide北京鼎國，北京)，限制型內(nèi)切酶EcoRI，BamHI和dNTP (10 mmol/L)(Takara，日本)，T4 DNA ligase(Promega，美國)，無血清培養(yǎng)基Opti-MEM(Invitrogen,美國)。L420型臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，PTC-200型熱循環(huán)儀(Bio-Rad,美國)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國)，5415D型離心機(jī)(Eppendorf,德國)，DK-8B型電熱恒溫水槽購自(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡和96孔培養(yǎng)板(OLYMPUS,日本)。

1.2 研究方法

1.2.1 BV2細(xì)胞培養(yǎng)：BV2細(xì)胞是小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株，使用DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素)在二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2，37 ℃條件)中培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 BV2細(xì)胞感染過表達(dá)5-LOX病毒/對(duì)照病毒： pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質(zhì)粒載體(圖1)。將Alox5序列信息序列直接合成至pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro載體上。復(fù)蘇并培養(yǎng)的293T細(xì)胞，給予DMEM完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細(xì)胞，培養(yǎng)過程中，每24 h換液，傳代比例為1∶5～1∶10。將pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收集上清液，濃縮制成病毒顆粒，同樣方法構(gòu)建空載體病毒。病毒顆粒感染BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，G418進(jìn)行細(xì)胞致死率篩選，挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆抗體細(xì)胞株。我們將G418藥物設(shè)置4個(gè)濃度梯度來細(xì)胞致死率的濃度篩選，濃度設(shè)置分別為200、300、400 μg/ml、500 μg/ml。細(xì)胞大量死亡出現(xiàn)在第3天到第8天中，除去死亡細(xì)胞，收集活下來的細(xì)胞形成單克隆，并將感染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質(zhì)粒

1.2.3 建立OGD/R 5-LOX過表達(dá)BV2細(xì)胞模型:5-LOX過表達(dá)的BV2細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集第三代細(xì)胞，胰蛋白酶將BV2細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化下來，BV2細(xì)胞制成懸液。調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞再次接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞中的完全培養(yǎng)液更換為無糖Earle’s液，利用三氣培養(yǎng)箱37 ℃下(94%氮?dú)狻?%二氧化碳、1%氧氣)建立缺氧缺糖模型。在氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)中，BV2細(xì)胞分為5-LOX病毒過表達(dá)組與CON空病毒載體組，氧糖剝奪分別0、1、2、4 h，復(fù)氧12 h，根據(jù)顯微鏡下拍攝OGD處理0、1、2、4 h的細(xì)胞形態(tài)，確立OGD/R 5-LOX過表達(dá)BV2細(xì)胞模型。

1.2.4 細(xì)胞給藥及分組:BV2細(xì)胞5-LOX過表達(dá)組與空載體對(duì)照組給予齊留通(Zileuton)、孟魯司特(Montelukast)、U75302被用來分別阻斷5-LOX，CysLTR1和BLT1通路。將細(xì)胞分為以下10組，正常組按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，給予完全培養(yǎng)液，并不進(jìn)行OGD/R的處理。5-LOX過表達(dá)組給予5-LOX過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染；除空白組外其他組均進(jìn)行缺糖缺氧/復(fù)氧處理，給藥組分別給予Zileuton、Montelukast、U75302處理。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

1.2.5 MTT檢測(cè)OGD/R5-LOX過表達(dá)BV2細(xì)胞的細(xì)胞活性：按照實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種與96孔板上，除空白組外，均進(jìn)行OGD/R處理細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活性檢驗(yàn)，除設(shè)空白孔外，空載體與5-LOX過表達(dá)10個(gè)分組，分別各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，放置于(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，每孔加入150 μl DMSO溶解沉淀。酶標(biāo)儀將波長(zhǎng)設(shè)置為570 nm，測(cè)出各孔的吸光度值。抑制率=[(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組]×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將空載體與5-LOX過表達(dá)10個(gè)分組的各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液混勻，室溫避光20 min，將避光后的細(xì)胞置于冰水混合物中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。PI熒光信號(hào)值用縱坐標(biāo)表示，Annexin-V-FITC熒光信號(hào)值表示為橫坐標(biāo)。碘化丙啶染色對(duì)正常細(xì)胞是無法染色的，LR區(qū)域?qū)儆诩?xì)胞膜完整，PI染色。UR區(qū)域中的細(xì)胞膜破裂，PI和Annexin-V-FITC均可染色。

2 結(jié) 果

2.1 全基因合成pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果比對(duì) 結(jié)果顯示(圖2)，Alox5測(cè)序結(jié)果比對(duì)結(jié)果顯示，pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質(zhì)粒全基因合成成功。

圖2 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質(zhì)粒

2.2 5-LOX過表達(dá)轉(zhuǎn)染后對(duì)BV2細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖3。與空載體對(duì)照組氧糖剝奪0 h對(duì)比，空載體對(duì)照組氧糖剝奪1、2、4 h后細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)改變，空白組細(xì)胞形態(tài)完整，呈現(xiàn)梭形?？蛰d體對(duì)照組OGD后細(xì)胞逐漸形成“阿米巴狀”，5-LOX過表達(dá)則增加細(xì)胞損傷，給藥組分別能減緩細(xì)胞的“阿米巴狀”。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，氧糖剝奪復(fù)氧時(shí)間，由細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)改變，我們選取缺氧4 h復(fù)氧12 h為腦缺血體外模型。

圖3 缺氧不同時(shí)間各組細(xì)胞形態(tài)(PI染色，×200)

2.3 OGD/R 5-LOX過表達(dá)對(duì)BV2細(xì)胞增殖影響 缺氧2 h復(fù)氧12 h處理?xiàng)l件下,檢測(cè)5-LOX過表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。第1組和第6組是未經(jīng)過OGD/R處理的空白對(duì)照組，第2組是空載體OGD/R模型組，第7組是5-LOX過表達(dá)OGD/R模型組?？蛰d體對(duì)照病毒OGD/R組與空白組相比活力降低，空載體對(duì)照組給予Zileuton(第3組)、Montelukast(第4組)、U75302(第5組)后，與OGD/R空載體對(duì)照組對(duì)比，給通路阻斷劑后，細(xì)胞活力較對(duì)照組有一定提高，且U75302活性優(yōu)于Montelukast。病毒空載體模型組(第2組)與5-LOX過表達(dá)病毒模型組(第7組)對(duì)比，5-LOX過表達(dá)后細(xì)胞活力下降，同樣給予Zileuton、Montelukast、U75302組的細(xì)胞活性比5-LOX病毒過表達(dá)OGD/R模型組(第7組)高，5-LOX過表達(dá)Zileuton(第8組)與Montelukas(第9組)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用基本接近，U75302(第10組)高于Zileuton(第8組)與Montelukas(第9組)。

2.4 OGD/R 5-LOX過表達(dá)對(duì)BV2細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在空載體對(duì)照病毒中，空白組(第1組)與模型組OGD/R(第2組)對(duì)比，OGD/R后細(xì)胞的凋亡明顯升高，給予Zileuton(第3組)、Monteluka、U75302(第5組)能夠減弱凋亡，空載體病毒Zileuton(第3組)明顯降低細(xì)胞凋亡，接近空白(第1組)，Montelukas(第4組)與U75302(第5組)降低細(xì)胞凋亡與模型組OGD/R對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。5-LOX過表達(dá)與空病毒空白組對(duì)比后，過表達(dá)的5-Lox病毒對(duì)細(xì)胞凋亡增加較小。模型組與空白組對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，給藥組與模型組對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

空病毒對(duì)照組中，UR和UL區(qū)域細(xì)胞染色都是0%，在LL區(qū)域99%，細(xì)胞膜完整，LR區(qū)域0.86%，表示僅有極少凋亡細(xì)胞；空病毒組OGD/R后，細(xì)胞分別在UR區(qū)域0.221%，UL區(qū)域0.412%，細(xì)胞膜破裂，膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸被染色；在空病毒Zileuton組，細(xì)胞集中LL區(qū)域，UL與UR區(qū)域0%，僅有LR區(qū)域1.44%的凋亡細(xì)胞；空病毒Montelukast組中UL與UR區(qū)域0%，LR區(qū)域凋亡細(xì)胞2.73%；空病毒U75302組中，UL區(qū)域0.021%，UR區(qū)域0.126%，LR區(qū)域2.56%，與Montelukast、Zileuton組對(duì)比，U75302組中細(xì)胞死亡和細(xì)胞壁破裂較多。5-LOX病毒過表達(dá)對(duì)照組中，UR區(qū)域0%，LR區(qū)域0.087%，在LL區(qū)域90.6%的細(xì)胞膜完整，LR區(qū)域9.32%，與空載體對(duì)照組相比，5-LOX過表達(dá)后，細(xì)胞膜破裂出現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)死亡和晚期凋亡；空病毒組OGD/R后，細(xì)胞分別在UR區(qū)域1.48%，LR區(qū)域10.9%，細(xì)胞凋亡與死亡進(jìn)一步增加；5-Lox過表達(dá)Zileuton組，細(xì)胞4個(gè)區(qū)域具有分布，UL:0.153%，UR:0.123%，LR:2.56%，細(xì)胞凋亡得到改善；5-LOX過表達(dá)U75302組中，UL:0.021%，UR:0.126%，LR:2.56%，與Zileuton組對(duì)比，U75302組中UR和UL區(qū)域細(xì)胞染色都是0%，在LL:97.1%，LR:2.87%，表示僅有極少凋亡，細(xì)胞死亡和細(xì)胞壁破裂減少。

3 討 論

CI/RI后引起繼發(fā)性損傷，炎性反應(yīng)的發(fā)生不但與MG等中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞活化有關(guān)[11]，損傷發(fā)生后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，變成具有吞噬能力的“阿米巴狀”，同時(shí)釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，會(huì)引起繼發(fā)性腦損傷。5-LOX屬于一類稱為脂氧合酶的酶，可氧化游離和酯化的多不飽和脂肪酸。5-LOX作用花生四烯酸代謝衍生白三烯，生成白三烯A4(LTA4)，LTA4通過其酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為白三烯B4(LTB4)和白三烯C4(LTC4)[12-13]。LTB4受體可分為BLT1和BLT2，LTC4可生成半胱氨酸白三烯受體CysLT1和CysLT2，它們可以識(shí)別白三烯LTD4、LTD4、LTE4和LTF4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出5-LOX過表達(dá)增加細(xì)胞損傷。以5-LOX過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞的手段，通過顯微鏡拍照觀察，在不同缺糖缺氧時(shí)間中，細(xì)胞形態(tài)損傷變化情況。并根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，篩選缺糖缺氧復(fù)氧模型的時(shí)間。BV2細(xì)胞采用OGD/R模型，模擬腦缺血再灌注損傷?；谇捌趯?duì)BV2的缺氧實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷后，BV2被激活，細(xì)胞炎性因子增加。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧超過4 h就會(huì)對(duì)BV2的生長(zhǎng)造成一定影響，缺氧1 h對(duì)細(xì)胞影響不大，但也不能很好的造成氧糖損傷模型，缺氧6 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)“阿米巴狀”較多，且BV2細(xì)胞的數(shù)量減少，細(xì)胞存活率下降。實(shí)驗(yàn)組最終確立模型時(shí)間為缺氧缺糖4 h，復(fù)氧12 h模型。

Zileuton作為5-LOX的抑制劑，它可有效地衰減在PC12細(xì)胞中的MG介導(dǎo)的魚藤酮毒性[14]。在實(shí)驗(yàn)研究中，5-LOX上調(diào)在低氧血癥患者的大腦皮層中，5-LOX在MG表達(dá)中升高[15]。這些結(jié)果表明5-LOX途徑與MG炎癥引起的神經(jīng)元死亡有關(guān)。LTB4和CysLT1和CysLT2是主要的促炎介質(zhì)，5-LOX途徑在許多疾病中均被激活引起炎癥反應(yīng)[16]。研究發(fā)現(xiàn)CysLTs在各種神經(jīng)調(diào)節(jié)過程具有重要調(diào)節(jié)作用，CysLTs及其受體與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，例如多發(fā)性硬化癥，帕金森氏病，亨廷頓氏病，癲癇和阿爾茨海默氏病[17]?？拱兹┧幬锓譃閮深悾篊ysLT受體拮抗劑(扎魯司特，普侖司特和孟魯司特Montelukast)和LTs抑制劑(5-脂氧合酶抑制劑，例如齊留通Zileuton，ZD2138，BayX1005和MK-0591)。白三烯B4(LTB4)參與多種疾病中發(fā)生的炎癥，U75302是BLT1受體拮抗劑，LTA4水解酶是LTB4生產(chǎn)中的限速酶，拮抗劑的使用均可以降低炎性反應(yīng)[18-19]。選擇性5-LOX抑制劑Zileuton和CysLTR1拮抗劑Montelukast可減輕膠質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷提高細(xì)胞活力[20]。U75302是LTB4的受體阻斷劑，使用U75302阻斷LTB4/BLT1信號(hào)通路已被用于緩解各種炎癥和線粒體功能障礙[21]。Montelukast是白三烯的受體抑制劑，它可以降低LPS刺激的人類嗜中性粒細(xì)胞活化，同時(shí)減輕急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)小鼠模型的炎癥[22]。

綜上所述，通過探索5-LOX通路在氧糖剝奪/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的5-LOX可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R的損傷和激活。在OGD/R誘導(dǎo)的腦缺血損傷中，5-LOX激活是通過5-LOX過表達(dá)介導(dǎo)的BV2細(xì)胞中CysLTRs/CysLTs和LTB4/BLTs途徑的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的，這一結(jié)果能夠?yàn)槟X缺血/再灌注損傷的診斷和臨床治療提供分子基礎(chǔ)[23]。