葉倩，汪祺，文海若

亞硝胺類化合物由亞硝酸鹽或氮氧化物等與胺類物質反應后生成，該反應可存在于藥品生產中的各個環(huán)節(jié)，來自原料藥的生產試劑、降解產物、包裝材料等。近年來，多種藥品中可發(fā)現(xiàn) N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）[1]，作為藥品雜質其遺傳毒性風險以及監(jiān)管限度的確定受到廣泛關注。除 NDMA 外，亞硝胺類化合物包括 N-亞硝基二乙胺（N-ethyl-N-nitrosoethanamine，NDEA）、N-亞硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基二異丙胺（N-nitrosodiisopropylamine，NDIPA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（N-nitrosoethyl isopropyl amine，NEIPA）等 120 余種。國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）將亞硝胺類化合物列為 2A 類致癌物，已有動物致癌數(shù)據(jù)，且機制研究提示其存在致癌風險[2]。在監(jiān)管方面，參考人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會發(fā)布的 ICH M7（2017年），亞硝胺類化合物屬于較高致癌風險的“關注隊列”（cohort of concern，COC）[3]。NDMA 和 NMBA 根據(jù)其大鼠的 50%致癌劑量（median toxic dose，TD50）值折算，成人每日最大攝入量不超過 96 ng；NDEA、NDBA、NDIPA 和 NEIPA 則為 26.5 ng[4]。

然而，并非所有亞硝胺類化合物均存在致突變性[5]。隨著對藥品中亞硝胺類雜質控制的重視，明確某個亞硝胺類化合物是否具有致突變性是界定其監(jiān)管限度的關鍵。細菌回復突變試驗（又稱 Ames試驗）是最常用的評價化合物是否具有基因突變風險的方法[6]。亞硝胺類化合物的致突變性主要與其代謝產物有關，其中 CYP2E1 為主要代謝酶[7-8]。大鼠肝微粒體 S9是最常用的 Ames 試驗的代謝活化系統(tǒng)，但鑒于不同種屬的 S9中所表達的酶含量有所不同，其對 N-亞硝胺類化合物的代謝能力有待考察。此外，常規(guī)的 Ames 試驗多采用平皿摻入法，為保證 S9與亞硝胺類化合物充分作用，文獻建議亞硝胺化合物的 Ames 試驗使用預培養(yǎng)法開展[9]。然而上述研究數(shù)據(jù)較為陳舊，對當前的試驗指導不佳。本研究以 NDMA 和 NDEA 為例，比較不同種屬來源 S9以不同培養(yǎng)方法對 Ames試驗結果的影響，為致突變活性與代謝活化有關的物質的 Ames 試驗條件確立提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）菌株 TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535和 TA1537 引自日本（株）生物科學中心（JBSINC），經分離篩選后對其是否存在氨基酸及生物素合成缺陷、細胞壁脂多糖缺失（rfa）、紫外線（uvrA或△uvrB）修復缺陷、抗氨芐青霉素及抗四環(huán)素（含 pKM101 或 pAQ1 質粒）等特性進行鑒定，鑒定結果符合要求后用于試驗[10]。

1.1.2 試劑和儀器 受試物 NDMA（純度 ＞95%）、NDEA（純度 ＞ 95%）均購自中國食品藥品檢定研究院；溶媒及陽性對照試劑二甲基亞砜（DMSO）、2-2-(呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺（2-2-furyl-3-5-nitro-2-furylacrylamide，AF-2）、2-氨基蒽（2-aminoanthracene，2-AA）、組氨酸、色氨酸、生物素、NADP、G-6-P 均購自美國 Sigma公司；疊氮鈉（NaN3）購自美國 Merck 公司；9-氨基吖啶（9-aminoacridine，9-AA）購自 Acros Organics 公司；營養(yǎng)肉湯（CM0067 nutrient broth No.2）購自英國 Oxoid 公司；瓊脂粉、葡萄糖購自北京索萊寶科技有限公司；MgSO4·7H2O、C6H5Na3O7·2H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4、KCl、MgCl2均購自國藥集團；CD-1 小鼠/SD 大鼠肝 S9混合液（由苯巴比妥鈉和 β-萘黃酮聯(lián)合誘導小鼠或大鼠肝臟制成）及人肝 S9混合液購自江蘇齊氏生物科技有限公司。

HERA cell VIOS 160i 二氧化碳培養(yǎng)箱為Thermo Fisher 公司產品；NU-543-400S 生物安全柜為 Nuair 公司產品；MIR-253 恒溫培養(yǎng)箱為三洋公司產品；CKX31 倒置顯微鏡為 Nikon 公司產品；NTS-1300 水浴搖床為 Eyela 公司產品；IS600細菌培養(yǎng)箱為 Yamato 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌回復突變試驗 瓊脂及溶液制備方法參見文獻[10]。細菌凍融液與營養(yǎng)肉湯混合后置于水浴搖床，在 37 ℃、120 r/min 條件下擴增 10 h，擴增后使用酶標儀對光密度進行檢測，估算活菌濃度達到 1 × 109個/ml 后用于試驗。根據(jù)受試物溶解度，并根據(jù)抑菌情況調整后，設置 5 個給藥濃度，分別在有/無 S9代謝活化條件下使用 6 孔板開展 Ames 試驗。每毫升 10% S9混合液中含有0.335 ml 滅菌注射用水、0.5 ml 0.2 mol/L 磷酸氫鈉緩沖液（pH 7.4）、0.04 ml 0.1 mol/L NADP 溶液、0.005 ml 1 mol/L G-6-P 溶液、0.02 ml 1.65 mol/L KCl-0.4 mol/L MgCl2溶液、0.1 ml S9溶液；每毫升 30% S9混合液中含有 0.135 ml 滅菌注射用水、0.5 ml 0.2 mol/L 磷酸氫鈉緩沖液（pH 7.4）、0.04 ml 0.1 mol/L NADP 溶液、0.005 ml 1 mol/L G-6-P 溶液、0.02 ml 1.65 mol/L KCl-0.4 mol/L MgCl2溶液、0.3 ml S9溶液。進行預培養(yǎng)法時，將S9混合液、亞硝胺類化合物及菌種混合加入滅菌玻璃管中，置于水浴搖床中 37 ℃、120 r/min 培養(yǎng)1 h 后再加入瓊脂鋪板。平皿摻入法則直接將 S9混合液、藥物、菌種和瓊脂混合均勻后鋪板。試驗設置 DMSO 溶媒對照組，每組平行 3 孔，所有樣本置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)約 48 h 后進行菌落計數(shù)，上述試驗重復 3 次。

1.2.2 菌落計數(shù)及結果判定 計數(shù)每孔中的回復菌落數(shù)量，每個濃度組分別求得均值，并以±s表示。TA1535 和 TA1537 試驗組平均每皿/孔中的回復菌落數(shù)大于溶媒對照組數(shù)值 3 倍，其他菌株試驗組平均每皿/孔中的回復菌落數(shù)大于溶媒對照組數(shù)值 2 倍且存在量效關系時判斷結果為陽性；反之為陰性。

2 結果

2.1 非代謝活化條件下的 Ames 試驗結果

本研究使用 6 孔板開展基于 6 種鼠傷寒沙門氏菌的 Ames 試驗。非代謝活化條件下，劑量范圍為 3.125 ～ 50 μg/孔的 NDMA 和 NDEA 無明顯抑菌性，且誘導的各菌回復突變菌落數(shù)與溶媒對照（0.1% DMSO）相比均未見明顯增加（表1）。

表1 非代謝活化條件下 Ames 試驗結果Table 1 Ames test results under non-metabolic activation conditions

2.2 不同來源 S9 對結果的影響

亞硝胺類化合物主要經 CYP2E1 代謝活化，但不同種屬所表達的 CYP2E1 有所不同。本研究分別使用含量為 10% 的大鼠 S9、小鼠 S9和人 S9開展試驗，并比較了平皿摻入法和預培養(yǎng)法處理后對結果的影響。所用濃度均為不產生明顯細菌毒性作用的濃度條件（即無明顯抑菌性），結果如表2 ～ 4 所示。平皿摻入法的大鼠 S9試驗中NDMA 和 NDEA 可誘導 TA97 的回復突變菌落數(shù)呈劑量效應相關性的增加，但與溶媒對照組比較增加倍數(shù)未達 2 倍及以上；預培養(yǎng)法的大鼠S9試驗中 NDMA 和 NDEA 可誘導 TA97 和TA1535 的回復突變菌落數(shù)呈劑量效應相關性的增加，且較高劑量（TA97 為 1000 μg/孔，TA1535 為500 μg/孔及以上）時與溶媒對照組比較增加倍數(shù)達2 倍以上。平皿摻入法的小鼠 S9試驗中 NDMA在 TA98、TA100，NDEA 在 TA100 中與溶媒對照組的回復突變菌落相比有輕微增加，但無明顯劑量相關性。預培養(yǎng)法的小鼠 S9試驗中 NDMA 和NDEA 誘導的各菌回復突變菌落數(shù)與溶劑對照組相比未見明顯增加。平皿摻入法和預培養(yǎng)法的人 S9試驗中 NDMA 和 NDEA 誘導的各菌回復突變菌落數(shù)與溶劑對照組相比均未見明顯增加?？梢?，經大鼠 S9預培養(yǎng)后，NDMA 和 NDEA 可導致更多菌株的更低濃度作用條件下的回復突變菌落數(shù)大幅增加。而經小鼠 S9和人 S9預培養(yǎng)后試驗結果與平皿摻入法的小鼠 S9試驗和人 S9試驗結果沒有明顯差別，提示預培養(yǎng)對于小鼠和人 S9試驗結果無明顯影響。此外，當 S9含量均為 10% 且受試物作用濃度相同的情況下，僅在大鼠 S9處理后（預培養(yǎng)法）NDMA 和 NDEA 的細菌致突變性結果為陽性，因此認為大鼠 S9的代謝活化效果最佳。

表2 不同試驗方法 10% 大鼠 S9 代謝活化后結果比較Table 2 Comparison of the results of 10% rat S9 metabolism activated by different test methods

表3 不同試驗方法 10% 小鼠 S9 代謝活化后結果比較Table 3 Comparison of the results of 10% mouse S9 metabolism activation with different test methods

表4 不同試驗方法 10% 人 S9 代謝活化后結果比較Table 4 Comparison of the results of 10% human S9 metabolism activated by different test methods

2.3 經大鼠 S9 代謝活化后的 Ames 試驗結果

為進一步考察最優(yōu)的代謝活化條件，本研究使用含量為 30% 的大鼠 S9在預培養(yǎng)條件下（37 ℃培養(yǎng) 1 h）開展試驗?；貜屯蛔兙溆嫈?shù)結果提示（表5）當前條件下 NDMA 可誘導 TA1535 回復突變菌落數(shù)為溶媒對照組（0.1% DMSO）的 3 倍；NDEA 可誘導 TA97、TA100、TA102 和 TA1535回復突變菌落數(shù)為溶媒對照組的 2 ～ 10 倍，與使用含量為 10% 的大鼠 S9開展的試驗結果進行比較出現(xiàn)陽性結果的菌株較多且濃度較低。由上述結果可知，NDMA 和 NDEA 的原型單體無明顯致突變性，但兩者的代謝活化后產物具有較強致突變性，且 NDEA 代謝產物的致突變性更強。

表5 大鼠 S9 代謝活化條件下 Ames 試驗結果Table 5 Ames test results under the condition of metabolic activation of S9 in rats

3 討論

本研究比較了有無 S9代謝活化、不同來源 S9以及預培養(yǎng)（增加 S9與受試物的相互作用）對Ames 試驗結果的影響。研究結果首先驗證了NDMA 和 NDEA 原型單體化合物無致突變性，經大鼠 S9充分代謝活化后則存在致突變性。含量為30% 的大鼠 S9代謝活化條件下，NDMA 可誘導TA1535（GC 堿基置換）突變率增加，而 NDEA 可誘導 TA97（GC 移碼突變）、TA100（GC 堿基置換）、TA102（AT 堿基置換）和 TA1535（GC 堿基置換）突變率增加。當前認為，烷化劑致癌的關鍵代謝途徑與 α-羥基化有關[11]。大多數(shù)情況下，該途徑為經細胞色素 P450 酶催化后產生的 α-碳氧化作用，而由此產生的羥基化中間體（α-亞硝基氨基醇）不穩(wěn)定，易于重排后形成醛和烷基重氮氫氧化物[12]。本研究的 Ames 試驗中啟動 I 相代謝反應，代謝活化產物的致突變性可能與發(fā)生上述反應有關。文獻報道，NDMA 經代謝后可形成重氮甲烷，并進一步反應形成甲基正離子[8]。兩者均可對 DNA 進行甲基化，從而導致堿基錯配而發(fā)生突變。NDMA 在大鼠中的 TD50為 0.096 mg/(kg·d)，主要表現(xiàn)為肝、腎、肺、睪丸腫瘤；在小鼠中的 TD50為 0.189 mg/(kg·d)，主要表現(xiàn)為肝和腦部腫瘤[13]。NDEA 在大鼠中的 TD50為 0.0265 mg/(kg·d)，主要表現(xiàn)為消化道和尿道腫瘤；在靈長類動物中的TD50為 0.007 ～ 0.054 mg/(kg·d)，主要表現(xiàn)為肝腫瘤[14]。相同暴露條件下 NDEA 的致癌風險略高于NDMA，致癌性試驗結果與 Ames 試驗結果相符。

S9混合液是 Ames 試驗代謝活化條件中的常用試劑，模擬受試生物體內代謝活化條件，用于考察受試物代謝產物的致突變風險。其成分為肝細胞除去細胞核、線粒體及碎片之后的部分，主要包括肝微粒體蛋白及肝細胞漿內的蛋白質[15]。試驗所用SD 大鼠 S9和 CD-1 小鼠 S9均為動物經口給予苯巴比妥鈉和 β-萘黃酮進行誘導后，再取動物肝臟勻漿制成。但人源的 S9在制備時未經誘導。不同種屬來源的 S9中所包括的代謝酶有所差異。人類肝臟勻漿在將亞硝胺代謝成誘變劑方面與未經誘導的大鼠肝臟勻漿相似，但觀察到個體間存在較大差異[16]。比較本研究結果可知大鼠 S9的代謝活化效果優(yōu)于小鼠 S9和人源 S9，NDMA 的致癌試驗數(shù)據(jù)也提示大鼠是其更為敏感的誘導腫瘤形成的種屬。然而，Malling[17]比較了小鼠肝微粒體和大鼠肝微粒體制劑對亞硝胺類物質代謝活化的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠肝微粒體通常比大鼠肝微粒體制劑更有效地激活亞硝胺成為誘變劑，與本研究結果相左。Nakajima 等[18]研究結果則提示雄性 B6C3Fl 小鼠肝臟中 CYP2El 含量高于雄性 Wistar 大鼠。故推測本研究中小鼠 S9對亞硝胺類化合物代謝能力不佳的原因可能與當前來源的小鼠 S9組分中CYP2E1 和 CYP2A6 含量較低或失活有關。此外，本研究發(fā)現(xiàn) 10% 的小鼠 S9和人 S9預培養(yǎng)法與平皿摻入法的結果差異不明顯，提示對于 NDMA和 NDEA 而言小鼠 S9和人 S9的代謝活化能力有限。總之，不同種屬的 S9對亞硝胺化合物的代謝活化情況主要取決于相關代謝酶含量，與所用動物品系、誘導方法、制備工藝等多重因素有關。人S9的代謝活化能力不佳也可能與 S9混合液成分配比有關，有待進一步研究。此外，市場上人 S9的價格約為大鼠 S9的 5 倍。因此，本研究結果提示使用大鼠 S9開展細菌回復突變試驗效果最佳，且性價比最優(yōu)。

綜上，本研究證實了使用經誘導的大鼠 S9檢測 N-亞硝胺類化合物致突變性的合理性。受試物與 30% 的大鼠 S9在 37 ℃ 條件下預培養(yǎng) 1 h后，可有效檢出 N-亞硝胺類化合物的致突變性，結果較為可靠。上述方法學摸索為 N-亞硝胺類化合物及其他代謝活化后產生致突變性物質的風險評價奠定基礎。