潘志恒，涂雪瑩

(佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528137)

近年來(lái)，硼親和材料可特異性吸附復(fù)雜基質(zhì)樣品中的順式二羥基化合物，廣泛應(yīng)用于糖蛋白、核苷酸、RNA等生物樣品的分離富集，這些生物分子對(duì)人類生命活動(dòng)及臨床醫(yī)學(xué)具有非常重要的研究意義，因此本文對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和綜述，以便為科研工作者提供參考。

1 硼親和材料的作用原理

硼親和是基于酸堿條件下，硼酸和順式二羥基化合物發(fā)生可逆共價(jià)反應(yīng)，作用原理如圖1所示，堿性條件下，硼原子與順式二羥基化合物發(fā)生共價(jià)結(jié)合，而在酸性溶液中，發(fā)生解離。

圖1 硼親和材料作用原理圖[1]

2 硼親和材料的發(fā)展

硼酸與順式二羥基化合物的結(jié)合反應(yīng)早在1838年被發(fā)現(xiàn)，之后硼酸與各種糖醇和順式二醇的相互作用被更多的研究；1949年，Boeseken首次用硼酸測(cè)定碳水化合物的構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下，很容易形成硼酸絡(luò)合物，紙層析分離顯色劑中加入硼酸，成功分離糖[2]；1959年，Lorand和Edwords研究了苯硼酸鹽水溶液離子與幾種多元醇的絡(luò)合平衡，證明了苯硼酸在堿性溶液中以sp3雜化的四面體存在[3]；1963年，Bourne等[4]證明了無(wú)環(huán)多羥基化合物在含有苯硼酸的溶劑中的RF值比它們衍生的醛糖或酮糖高得多，并提供了快速分離這類化合物對(duì)的方法。weith等[5]在1970年研究了含二羥基硼基纖維素衍生物的合成及其與糖和核酸形成絡(luò)合物的能力，并制成分離純化色譜柱，用于糖類和核酸的分離，此后硼親和材料得到迅速發(fā)展。2006年Hilder等[6]結(jié)合整體柱和硼親和材料的特點(diǎn)，研制了適合于微型硼酸鹽親和色譜的新型大孔整體固定相材料，大大擴(kuò)大了硼親和的應(yīng)用范圍。此后十多年時(shí)間里面，一系列具有獨(dú)特功能的硼親和材料被開發(fā)出來(lái)，包括硼親和納米材料、大孔整體柱、介孔材料、溫敏材料、硼親和分子印跡聚合物等，這些材料在代謝組學(xué)、糖組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，極大拓寬了分離純化的對(duì)象，包括小分子化合物(類固醇、酮類、苷類、沙丁醇胺等)，大分子化合物(糖蛋白、多肽等)，基于硼親和相互作用的仿生分離介質(zhì)在純化抗體和疾病特異性抗原等領(lǐng)域顯示了先天優(yōu)勢(shì)。

3 硼親和材料的種類

3.1 大孔整體柱

大孔整體柱是由單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和致孔劑的混合物在空柱管內(nèi)原位聚合得到的連續(xù)多孔高聚物固體材料，材料表面可根據(jù)需要作相應(yīng)的功能化衍生化，通過(guò)調(diào)整聚合單體的結(jié)構(gòu)、比例、聚合溫度、時(shí)間等條件，可以制備具有不同孔徑及分布的功能性整體柱，以適應(yīng)不同需求和分離模式，整體柱通常具有制備簡(jiǎn)單、通透性好、柱壓低的特點(diǎn)[7]。研究者們結(jié)合整體柱和硼親和技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，制備了各類硼親和整體柱，包括有機(jī)聚合物整體柱、有機(jī)無(wú)機(jī)雜化整體柱、分子印跡整體柱。

3.1.1 無(wú)機(jī)硅膠整體柱

無(wú)機(jī)整體柱相對(duì)于有機(jī)基質(zhì)來(lái)說(shuō)，硅膠無(wú)機(jī)硅膠整體柱在機(jī)械強(qiáng)度、耐高壓、化學(xué)穩(wěn)定性等方面具有優(yōu)勢(shì)，其表面豐富的硅羥基非常有利于化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行表面修飾改性，可用于制作各種固定相，廣泛用于小分子的分離、純化和分析。但是，其pH值適用范圍比較窄，在堿性溶液中穩(wěn)定性差。近年來(lái)有學(xué)者用金屬材料制作硼親和材料，金屬硼酸鹽具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)類型，使其在傳統(tǒng)的微孔材料的催化、吸附、分離、熒光材料等領(lǐng)域都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.1.2 硼親和有機(jī)聚合物整體柱

制備有機(jī)聚合物整體柱的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，通常是將單體混合物及致孔劑注入到空管柱中，除氣泡，經(jīng)熱、紫外光或者γ-射線引發(fā)使單體混合物聚合，得到連續(xù)多孔機(jī)物聚合物材料，這種材料的形狀是集成的，孔結(jié)構(gòu)與其他色譜柱不同，可以使液體直接流過(guò)較大的介孔。其單體來(lái)源廣泛，制備簡(jiǎn)單，可耐受更高的pH范圍和更高的溫度，具有良好的生物相容性。2006年，Hilder等[6]制備了第一批硼親和有機(jī)聚合物整體式柱，并利用液相色譜和毛細(xì)管電色譜有效分離了核苷類化合物。2009年，Liu等[8]研制了“一步法”制備硼親和有機(jī)聚合物整體柱，解決了后修飾方法的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺陷。

3.1.3 有機(jī)無(wú)機(jī)雜化整體柱

有機(jī)聚合物整體柱雖然適用的pH值范圍比較廣(pH 1～14)，且容易制備，但是由于骨架是純有機(jī)化合物，剛性不足，耐熱穩(wěn)定性低，不耐有機(jī)溶劑的溶脹作用，由此在一定程度上限制了其應(yīng)用，而無(wú)機(jī)硅膠整體柱和有機(jī)聚合物整體柱相比，正好互補(bǔ)了其缺點(diǎn)，因此，為了克服有機(jī)聚合物整體柱的不足，新型的有機(jī)無(wú)機(jī)雜化整體柱由此而生。劉震等制備了一種獨(dú)特的硼親和雜化整體柱，其可在中性或者弱酸性條件下分離生物分子，如分離人尿中的腺苷[9]。

3.2 硼親和介孔材料

根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的定義，多孔材料可以分為三種：微孔材料(孔徑<2 nm)、介孔材料(2 nm<孔徑<50 nm)和大孔材料(孔徑>50 nm)。介孔材料具有超高比表面積、大的孔容、可調(diào)控的孔尺寸和形貌特性，同時(shí)介孔材料的孔壁和孔道結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出納米尺寸效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于樣品的分離和前處理，其中介孔硅材料較易于被硼親和修飾。硼親和介孔硅材料目前主要用于兩個(gè)方面，一是分離富集，二是藥物釋放。Xu等[10]在 2009 年首次制備了硼親和介孔材料，先用 γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO) 與 3-氨基苯硼酸反應(yīng)，得到的產(chǎn)物再與介孔硅反應(yīng)，該硼親和材料能夠用于糖肽的選擇性富集，這是第一次將介孔材料引入糖蛋白組學(xué)中來(lái)，與直接(傳統(tǒng))分析相比，這種新方法使糖肽的檢測(cè)限提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。有機(jī)硼酸基團(tuán)的無(wú)偏性質(zhì)也使得該方法適用于所有類型的糖肽。

3.3 硼親和納米材料

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。目前，越來(lái)越多的納米材料作為吸附劑提高有效成分的提取率。磁性納米材料具有易分離、表面改性、吸附能力強(qiáng)、生物相容性好等特點(diǎn)，在樣品預(yù)處理、分離純化等方面得到了廣泛的應(yīng)用。硼親和磁性納米材料對(duì)于分離純化順式二羥基化合物具有明顯優(yōu)勢(shì)，但是其與糖蛋白的結(jié)合力普遍較弱，因此很難分離富集低含量的糖蛋白。劉震等利用多位點(diǎn)協(xié)同作用，合成了具有協(xié)同作用的樹枝狀硼親和磁性納米材料(dBA-MNPs)，其與糖蛋白的親和力比普通的材料相比，提高了1000～10000倍，可以用于分離濃度低至2×10-14mol/Ld 糖蛋白[11]。

3.4 硼親和分子印跡聚合物

分子印跡技術(shù)又叫做分子印記技術(shù)、分子烙印技術(shù)或分子模板技術(shù)，是一種新興的分子識(shí)別技術(shù)，其目的是制備對(duì)模板分子具有特異選擇性識(shí)別能力的聚合物，即分子印跡聚合物(MIPs)。由于該技術(shù)具有預(yù)定性、可識(shí)別性和實(shí)用性等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域(如色譜分離、固相萃取、仿生傳感、模擬酶催化、臨床藥物分析等)中得到了廣泛的應(yīng)用。劉震等提出了制備糖蛋白的分子印跡聚合物的通用方法，并發(fā)展制備了糖蛋白的分子印跡聚合物圖案化陣列的軟光刻方法。該方法由于采用了快速的光聚合法避免了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[12]。在此基礎(chǔ)上，其又提出了基于硼親和作用的可控定向表面印跡法，不僅可以制備二維陣列，還可以制備分子印跡整體柱[13]。

3.5 硼親和溫敏材料

Roohi等[14]采用偶氮引發(fā)劑改性的介孔二氧化硅微球，通過(guò)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)介導(dǎo)的聚合反應(yīng)，接枝溫度敏感聚合物(聚-N-異丙基丙烯酰胺，PNIPAAM)。該材料對(duì)五種疏水類固醇的分離是有效的，當(dāng)柱溫高于PNIPAAM的最低臨界溶液溫度時(shí)，保留時(shí)間和分離效率都隨著柱溫的升高而提高。Li等[15]的研究表明 2，4-二氟-3-甲酰基苯硼酸(DFFPBA)具有超高的硼酸與單糖的結(jié)合親和力，而且具有適當(dāng)間隔臂的單體對(duì)小分子量的順式二醇具有較低的結(jié)合pH值(6.0)，這些優(yōu)點(diǎn)使得DFFPBA功能化整體柱適合于在中性和弱酸性真實(shí)樣品中富集痕量順式二醇類化合物。Lu等[16]報(bào)道了一種pH值調(diào)控策略，用于微調(diào)硼親和整體柱對(duì)兩類糖蛋白的特異性，即唾液酸化和非唾液酸化糖蛋白。

4 硼親和納米材料的應(yīng)用

4.1 對(duì)糖蛋白的分離富集應(yīng)用

很早之前，人們就已經(jīng)利用硼親和色譜材料對(duì)順式二羥基化合物進(jìn)行分離純化，主要是糖類及一些糖蛋白。硼親和配體在堿性條件下可以與順式二羥基分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的五元環(huán)或者六元環(huán)，而在酸性環(huán)境下，可逆的解離釋放出順式二羥基分子。因此，在糖類、糖蛋白及兒茶酚物質(zhì)的分析檢測(cè)方面，相對(duì)與凝集素親和色譜、親水作用色譜等其他方法，具有簡(jiǎn)單便捷高效的優(yōu)勢(shì)。隨著糖蛋白組學(xué)的發(fā)展，糖蛋白的分離檢測(cè)越來(lái)越具有重要意義。糖蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮至關(guān)重要的勝利作用，許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)糖基化有關(guān)，如在腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生不同水平蛋白質(zhì)糖基化。但是體內(nèi)糖蛋白的含量水平是非常低的，而且存在于成分復(fù)雜的生理體液當(dāng)中，濃度高的蛋白對(duì)于糖蛋白的檢測(cè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的干擾和信號(hào)掩蓋等問(wèn)題，因此必須采取必要的手段對(duì)糖蛋白進(jìn)行富集，其中硼親和材料的應(yīng)用是最廣泛的，而且在不斷發(fā)展。Song等首次在金電極的表面修飾了硼酸基團(tuán)，并用于血漿樣品中糖基化血紅蛋白的檢測(cè)[17]。電化學(xué)檢測(cè)手段屬于在線檢測(cè)，工序簡(jiǎn)便省時(shí)，周期短，也為糖蛋白的檢測(cè)提供了發(fā)展的空間。

4.2 對(duì)糖的分離富集應(yīng)用

血糖監(jiān)測(cè)對(duì)于臨床診斷、控制和治療糖尿病是至關(guān)重要的，基于硼親和的電化學(xué)葡萄糖傳感器對(duì)糖尿病患者在臨床上的血糖水平檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景，如柏占明構(gòu)建了基于硼親和作用的夾心型葡萄糖電化學(xué)傳感器，能夠在 0.5～20.0 mM的范圍較好的檢測(cè)糖原水平[18]。

4.3 對(duì)核苷的分離富集應(yīng)用

核苷是核酸的主要組分，一些核苷及其衍生物具有重要的生理功能，例如，肌苷可以治療急慢性肝炎和風(fēng)濕性心臟病。許歡歡采用表面引發(fā)-可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(SI-RAFT)技術(shù)，制備了一種高吸附容量、吸附動(dòng)力快、選擇性高的的新型硼酸親和吸附劑用于血清樣品中核苷的分離富集，檢測(cè)出小牛血清中尿苷和鳥苷的含量分別為(170±1.6) ng/mL 和(39.6±4.4) ng/mL[19]。

4.4 對(duì)兒茶酚胺的分離富集應(yīng)用

兒茶酚胺是一種含有兒茶酚和胺基的神經(jīng)類物質(zhì)，越來(lái)越多的證據(jù)表明它們?cè)诩膊〉陌l(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。許多學(xué)者對(duì)兒茶酚胺進(jìn)行了研究，現(xiàn)階段最重要的研究目標(biāo)是如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。Ozdemir等將氨基苯硼酸鍵合在氯甲基化的樹脂球上，制備了3-氨基苯基硼酸功能化聚(3-氯-2-羥丙基甲基丙烯酸酯)(APBA功能化聚(HPMA-Cl))微球，用于兒茶酷胺的分離，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APBA功能化聚(HPMA-Cl)微球是一種很有前途的兒茶酚胺吸附劑[20]。

4.5 藥物分析檢測(cè)和傳遞的應(yīng)用

藥物檢測(cè)由于生物樣品中干擾比較多，所以樣品的處理就尤為重要，王薇等采用硅膠為基質(zhì)，通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)的方法合成了一種新型高容量硼酸吸附劑，在目標(biāo)物質(zhì)與干擾物質(zhì)摩爾比為 1:50和1:100時(shí)，含有順式鄰二醇的藥物均能被有效的萃取出來(lái)[21]。

4.6 核酸適配體篩選應(yīng)用

核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行強(qiáng)特異性的穩(wěn)定結(jié)合，它主要是借由一種被稱為SELEX法德人工篩選程序產(chǎn)生的，它已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的重要研究工具。適配體靶標(biāo)范圍廣，靶標(biāo)的大小與可溶性均不同，因此應(yīng)用 SELEX 技術(shù)篩選核酸適配體可以采用不同的具體操作方法。Ma Yanyan等作首次提出基于硼親和分子印跡技術(shù)的適配體篩選新方法用于糖蛋白核酸適配體篩選[22]。該方法以甘氨酸印跡磁性納米粒(MNPs)作為與靶糖蛋白結(jié)合的親和力界面，并將靶糖蛋白結(jié)合MNPs作為適體選擇的親和力子，然后將目標(biāo)糖蛋白結(jié)合的MNPs作為親和底物進(jìn)行適體選擇，該方法快速、高效、特異性強(qiáng)，而且大大降低了陰性篩選的概率。

5 結(jié) 語(yǔ)

硼親和材料作為獨(dú)特的親和色譜技術(shù)，由于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的需要，在近十多年里迎來(lái)了一個(gè)快速發(fā)展階段。目前的硼親和材料突破了常規(guī)硼親和材料只能用于堿性pH環(huán)境的限制，適用的pH范圍擴(kuò)大中等酸性環(huán)境，覆蓋了常見的生理樣品pH范圍，因此大大擴(kuò)寬了其在糖蛋白疾病標(biāo)志物識(shí)別等領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)，多位點(diǎn)協(xié)同作用可以有效解決硼親和材料親和力若的缺點(diǎn)，展現(xiàn)了硼親和材料在仿生分離介質(zhì)方面的美好前景。隨著一些基本問(wèn)題的解決，硼親和材料將會(huì)在復(fù)雜生物樣品分離純化中有更大的發(fā)展空間和更廣闊的應(yīng)用。