趙玉洋，秦雯，李源森芋，袁媛*，金艷，張輝，蔣超*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700；2.北京城市學院，北京 100083；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，深圳 518029

紫河車（Placenta Hominis）為健康人的干燥胎盤，具有溫腎補精、益氣養(yǎng)血之功效[1]。生血丸、安坤贊育丸、補腎固齒丸、河車大造丸、益血生膠囊等中成藥均含有紫河車。近年來，由于紫河車來源稀缺，藥材市場上充斥著使用豬、牛、羊的胎盤冒充紫河車的現(xiàn)象，大大降低了紫河車臨床用藥的安全性和有效性[2]。歷版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）收載的紫河車質量標準簡單，檢測指標缺乏專屬性，不易鑒別藥材及其產(chǎn)品的真?zhèn)巍?/p>

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，經(jīng)中醫(yī)臨床配方后，供患者即沖即服的顆粒[3]。中藥干浸膏粉為中藥材經(jīng)提取、分離、濃縮后的浸膏干燥后所得的物料，也是制備中藥顆粒劑、片劑、膠囊劑等固體制劑的中間物料[4]。研究表明，目前配方顆粒存在制劑原料以次充好、藥材品種混用嚴重、產(chǎn)品質量優(yōu)劣不一等問題[5?7]。傳統(tǒng)的中藥飲片可以通過性狀鑒別進行客觀評價，但中藥配方顆粒及浸膏通過加工制備后失去了原料的性狀特征，因此，需要建立針對中藥配方顆粒和干浸膏的合理、科學、快速、簡便的檢驗方法[8?9]。

與傳統(tǒng)鑒別方法相比，聚合酶鏈式反應（PCR）技術最大的特點是不受樣品形態(tài)限制，對于中藥材、中藥飲片乃至含有生藥原粉的中藥劑型均可應用，具有準確性高、重復性好等優(yōu)勢[10]。李慧等[11]利用位點特異性PCR 方法成功鑒別了紅天麻、烏天麻及其雜交天麻。田娜等[12]建立的多重位點特異性PCR鑒別方法,可同時鑒別滬地龍和廣地龍。孟虎彪等[13]使用位點特異性PCR 技術建立了一種穩(wěn)定、準確鑒定牛膝和川牛膝配方顆粒的方法。崔占虎等[14]建立了一種藥材水提液DNA 提取方法，并利用位點特異性PCR 方法鑒別斷腸草與金銀花類藥材水提液基原。相關研究依據(jù)金銀花差異單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點建立了一種位點特異性PCR方法鑒定金銀花植物及其配方顆粒真?zhèn)蝃15?16]。

《中國藥典》2020 年版收載了分子生物學檢查法1001“聚合酶鏈式反應法”[17]，特異性PCR 鑒定已廣泛應用于中藥材提取液、中成藥、貴細藥材、配方顆粒的基原鑒定中，不僅為特異性藥材的鑒別提供解決方法，也提高了臨床用藥的安全性。本文擬建立紫河車飲片、干浸膏粉及配方顆粒PCR 鑒別方法，為規(guī)范紫河車及其產(chǎn)品質量提供檢測工具。

1 材料

1.1 儀器

Veriti?型PCR儀、GeneAmp 9700型PCR儀（美國Applied Biosystem 公司）；PTC?100 型PCR 儀、SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Gene 公司）；TC?512型PCR儀（上海Techne公司）。

1.2 試藥

紫河車飲片（批號：ZHC001～013）及混偽品羊胎盤（批號：YTP001～029）由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供；豬（學名：Sus scrofa）購于北京第五肉聯(lián)廠；牛（學名：Bos taurus）購于鮮匯生鮮超市。憑證標本經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥資源中心蔣超副研究員進行形態(tài)鑒定后，保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心。

紫河車干浸膏粉樣品由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供，紫河車配方顆粒樣品購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，配方顆粒企業(yè)分別為A、B、C、D，見表1。

表1 紫河車實驗材料來源信息

Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒（美國promega 生物公司，批號：A2360）；DNeasy?Blood &Tissue Kit 試劑盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 試劑盒（德國凱杰生物技術有限公司，批號分別為69504、28306）。

2×M5 SuperTaqPCR Master Mix（北京聚合美生物技術有限公司，批號：MF164?01）；rTaqDNA聚合酶（批號：R001B）、Mighty Amp DNA 聚合酶（批號：R071A）、TaqDNA 聚合酶（批號：M0273）均購自大連TaKaRa 公司；Trans 2K DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司，批號：BM101）。

2 方法

2.1 DNA提取

分別使用Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒、DNeasy?Blood&Tissue Kit 試劑盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 試劑盒，依據(jù)說明書操作步驟提取紫河車飲片、干浸膏粉及配方顆粒的DNA。樣品模板DNA提取后，置-4 ℃保存。

2.2 引物設計

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載中藥紫河車及混偽品牛、羊、豬COⅠ序列，使用引物設計軟件Premier Primer 5.0 設計鑒別引物覆蓋中藥紫河車COⅠ序列，篩選引物穩(wěn)定區(qū)間，使用BioEdit 軟件將紫河車引物穩(wěn)定區(qū)間與混偽品牛、羊、豬進行對應的序列對齊，識別穩(wěn)定區(qū)間內差異SNP鑒別位點；使用Primer Premier 5.0軟件設計紫河車配方顆粒特異性鑒別引物（圖1）。ZHC492F：5′?AAACCCCCTGCCATAACC?3′；ZHC492R：5′?GAGGTTGCGGTCTGTTAGTAGTA?3′由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 紫河車特異性鑒別引物設計

2.3 PCR擴增條件

使用上述特異性鑒別引物對紫河車飲片及其干浸膏粉、配方顆?？侱NA模板進行擴增，初始PCR反應體系：反應總體積為25 μL，包含2×M5 SuperTaqDNA 聚合酶12.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA模板1 μL，用無菌雙蒸水（ddH2O）補足剩余體積。初始反應程序：95 ℃預變性3 min，55 個循環(huán)（94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終延伸5 min，15 ℃保溫。PCR 反應結束后，取反應產(chǎn)物7 μL，點樣于溴化乙錠（EB）染色的1.5%瓊脂糖凝膠上，200 V 電壓條件下電泳8～10 min，置SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察。

分別考察退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板量、Taq酶種類、Taq酶用量、PCR 儀型號等因素，確定最佳反應體系和反應參數(shù)，并使用最佳條件對紫河車飲片、干浸膏粉及配方顆粒樣品進行PCR 鑒別，驗證該體系是否能穩(wěn)定、準確地鑒別紫河車樣品及其混偽品。

3 結果與分析

3.1 DNA提取方法考察

將2.1 項下DNA 提取物進行PCR 擴增，發(fā)現(xiàn)Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒提取后擴增效果最好，其提取的紫河車飲片、干浸膏粉及配方顆粒均能產(chǎn)生單一條帶（圖2）。

圖2 紫河車DNA提取方法考察

3.2 PCR鑒別條件考察

分別對PCR 鑒別的關鍵影響因素退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板質量濃度進行系統(tǒng)考察。結果顯示，當退火溫度為60 ℃，循環(huán)數(shù)為33 次，DNA 模板質量濃度100 mg·L-1時紫河車飲片、干浸膏粉、配方顆粒均可擴增獲得約110 bp 單一特異性鑒別條帶，其混偽品及陰性對照均無條帶（圖3）。Taq酶種類影響特異性鑒別結果，其中，2×M5 SuperTaqPCR 聚合酶效果最佳，紫河車、干浸膏粉及配方顆粒均有單一條帶，見圖4 A。不同型號PCR 擴增儀對結果影響較小，使用4 種不同PCR 擴增儀均能準確鑒別紫河車飲片、干浸膏粉及配方顆粒（圖4 B）。

圖3 退火溫度、循環(huán)次數(shù)及DNA模板量對紫河車PCR鑒別結果的影響

圖4 Taq酶種類和PCR儀對紫河車PCR鑒別結果的影響

3.3 方法適用性考察

使用篩選出的反應條件，對所采購的紫河車飲片、干浸膏粉、不同廠家的紫河車配方顆粒及豬、牛、羊混偽品進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)紫河車飲片、干浸膏粉及不同生產(chǎn)廠家的配方顆粒均產(chǎn)生約110 bp 的單一特異性條帶，混偽品和空白對照無條帶（圖5）。

圖5 紫河車PCR方法學適用性考察

4 結語

當前對紫河車的鑒定研究主要針對紫河車飲片，如孔朝輝[18]詳細描述了紫河車的形態(tài)特征；張穗[19]通過對比正偽品胎盤組織的顯微特征，發(fā)現(xiàn)紫河車的顯微特征具有明顯差異點，可用于鑒別其正偽品；靳維榮等[20]通過薄層色譜法建立了適用于紫河車真?zhèn)舞b別的理化鑒別方法；陳俊等[21]基于紫河車及其混偽品種間COⅠ序列差異，建立了紫河車及其混偽品的鄰接樹，結果表明，基于COⅠ序列的DNA 條形碼可用于紫河車的真?zhèn)舞b別。而對于紫河車經(jīng)加工處理后的制品，如提取物、配方顆粒等，仍缺少準確、簡便、快速的鑒定方法。

本研究通過紫河車與其偽品的COⅠ序列比對，發(fā)現(xiàn)其特異性SNP 位點，并對直接影響鑒別特異性的PCR 退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板質量濃度、Taq酶種類等核心因素進行考察，并依據(jù)最佳鑒別條件進行了系統(tǒng)的方法學適用性考察，建立了一種適用于紫河車、干浸膏粉及配方顆粒中藥基原真?zhèn)舞b別的方法。在紫河車、干浸膏粉及配方顆粒樣品中均能擴出約110 bp 的單一特異性鑒別條帶，偽品羊胎盤、牛、豬均無條帶。使用建立的特異性鑒別方法對不同廠家生產(chǎn)的紫河車配方顆粒進行檢驗，結果顯示，28 批樣品均能檢出紫河車源性成分，表明本研究建立的紫河車特異性鑒別方法對配方顆粒具有適用性。