蘇潔，周瑞*，王梅，張海潮，劉妍如，劉紅波，宋忠興，楊莎，唐志書

1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）為常見的關節(jié)類疾病，臨床一般表現(xiàn)為膝、髖等大關節(jié)的疼痛、單側(cè)關節(jié)僵硬，嚴重者甚至會出現(xiàn)關節(jié)畸形、脫位，影響患者日常生活[1]。OA 屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，為五體痹之一。風寒濕邪內(nèi)侵人體筋骨關節(jié)，致經(jīng)脈氣血閉阻，肢體沉重、拘攣屈曲，關節(jié)劇痛?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》記載“腎主骨”[2]10、“腎生骨髓”[2]43，《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞》記載“腦為髓之?！薄八韬Ｓ杏?，則輕勁多力，自過其度；髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒?！盵3]100腎充養(yǎng)骨骼，腎充則髓實。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》逆調(diào)論中記載：“病名曰骨痹，是人當攣節(jié)也?！盵2]56以腎虛髓涸，致筋燥失養(yǎng)，攣縮而急。故在祛除風寒濕邪之時，當補益肝腎，以達到扶正祛邪之效。秦七風濕方（Qinqi Rheumatism Formula，QRF）為陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院楊秀清教授的臨床經(jīng)驗方，常用于治療類風濕性關節(jié)炎，該方源于秦嶺特色藥材陜西“太白七藥”，由珠子參（扣子七）、秦艽、山茱萸組成，方中君藥珠子參，有補肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血之效，文獻報道其具有鎮(zhèn)痛、抗炎[4]及免疫調(diào)節(jié)[5]等藥理活性。臣藥秦艽善治風濕痹痛、半身不遂等證，具有祛風濕、止痹痛、清濕熱等功效，增強君藥祛瘀止痛之效。山茱萸以果肉入藥，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，臨床多用于補益肝腎、收澀固脫，文獻記載其具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌等多種藥理活性[6]，在QRF 中為佐使藥，補益肺腎之氣，調(diào)和君藥珠子參的寒性，同時引藥下行入腎經(jīng)。三藥配伍共行通痹止痛、清濕熱、補益肝腎之效，配伍得當，溫而不燥，補而不過。

OA高發(fā)于老年人群，在治療過程中，使用消炎藥、止痛藥的不良反應較嚴重，而進行關節(jié)置換手術需要承擔較高風險，因此尋找合適的藥物進行緩解及干預治療十分必要。在臨床中QRF 已被證實對類風濕性關節(jié)炎（RA）所表現(xiàn)的關節(jié)肌肉疼痛、屈伸不利等癥狀有明顯改善作用，且QRF 全方在通痹止痛基礎上，更有補益腎氣、扶正祛邪之效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，QRF 能夠顯著抑制脂多糖（LPS）誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 分泌炎癥細胞因子一氧化氮（NO）[7]，在昆明種小鼠體內(nèi)有較強的鎮(zhèn)痛作用，具有抑制免疫功能的作用[8]，同時初步發(fā)現(xiàn)其對碘乙酸鈉誘導的軟骨細胞損傷具有一定的保護作用[9]。以上研究表明，QRF 具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，因此推測QRF 可能對OA 有干預作用。目前關于QRF 干預OA 的臨床研究和實驗報道較少，本課題基于系統(tǒng)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，建立QRF干預OA 的靶點網(wǎng)絡，對QRF 作用于OA 的活性成分及作用機制進行預測分析，并通過分子對接及體外實驗進行驗證。OA 在臨床中常表現(xiàn)為滑膜炎癥，患者滑膜組織中存在大量活化的巨噬細胞，提示巨噬細胞可能在OA 的發(fā)生、發(fā)展中具有關鍵作用[10]。因此，本課題組通過LPS 誘導RAW264.7細胞構建炎癥模型，研究QRF 的體外抗炎活性，為QRF 干預OA 的臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 細胞

RAW264.7細胞購自于中國科學院上海細胞庫。

1.2 試藥

珠子參（批號：20191105）、秦艽（批號：20200511）和山茱萸（批號：20200321）飲片均購于陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學劉世軍教授鑒定，分別為五加科植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk）C.Y.Wu et K.M.Feng.的干燥根莖、龍膽科植物秦艽Gentiana macrophyllaPall.的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉；胎牛血清（FBS，批號：1924622）、青?鏈霉素（批號：0010419）、RPMI 1640 培養(yǎng)液（批號：2038151）均購于Biological Industries 公司；CCK?8試劑（批號：SB793，Dojindo Laboratories 公司）；LPS（批號：L4391，Sigma公司）；腫瘤壞死因子?α（TNF?α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號：M170228?102a，欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 儀器

Multiskan GO 型全波長酶標儀、I50i/240i型CO2細胞培養(yǎng)箱、Legend Micro 17R型高速冷凍微量離心機、ECO 0.9型超凈工作臺（Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 QRF化學成分及成分靶點收集

基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、SymMap（https://www.symmap.org/）及中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）[11?13]及相關文獻收集珠子參、山茱萸、秦艽3 味中藥所含的活性成分及成分對應的靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范、校正靶點簡稱。

2.2 OA相關靶點收集及成分?疾病靶點交集

以“骨性關節(jié)炎（Osteoarthritis）”為關鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）及DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中對疾病進行搜索，得到與OA 疾病相關的靶點蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行校正并去除重復靶點，即得OA 相應的疾病靶點。運用在線作圖網(wǎng)站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對成分靶點及疾病靶點進行映射，收集成分可能作用于疾病的靶點。

2.3 蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建及生物學功能與代謝通路的富集分析

在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://String?db.org/）中將成分、疾病的共有靶點進行PPI 網(wǎng)絡的分析構建，將種屬選項選擇“智人（homo sapiens）”，Clusters 選擇“kmeans clustering”選項，設置3 個集群，其他參數(shù)保持默認值，將PPI 結果以.png 格式導出保存。在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫中對所得的預測靶點進行分析，通過基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫分別對靶點蛋白進行生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）富集分析，通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行相關靶點的代謝通路富集分析。使用在線作圖網(wǎng)站微生信輸出結果。

2.4 藥物?成分?靶點?通路網(wǎng)絡構建分析

根據(jù)KEGG 代謝通路的富集結果，進一步將富集得到的通路與3 味藥物、關聯(lián)成分及靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建QRF 的藥物?成分?靶點?通路網(wǎng)絡。

2.5 分子對接虛擬篩選

2.5.1 蛋白受體結構的準備 通過UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索網(wǎng)絡藥理學預測出的核心靶點的三維結構，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do）中下載蛋白質(zhì)大分子的.pdb 格式文件。在UCSF Chimera 1.15rc軟件中去除大分子蛋白結構中的晶體結構及水分子等小分子物質(zhì)，對蛋白結構進行加氫、計算電荷、能量最小化處理后，保存為.mol2格式。

2.5.2 活性成分配體結構的準備 通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找網(wǎng)絡藥理學預測活性成分及陽性對照藥物塞來昔布（Celebrex）的CAS 號，在SciFinder?Explore 數(shù)據(jù)庫（https://scifinder.cas.org/scifinder/view/scifinder/scifinder Explore.jsf）的Substance Identifier 項下檢索活性成分，并保存其二維化學結構的.mol 格式。通過ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件規(guī)整二維化合物結構式，保存為.cdx 格式，通過Chem3D 19.0 軟件進行能量最小化處理，保存小分子配體為.mol2格式。

2.5.3 成分靶點對接 在UCSF Chimera 1.15rc 軟件中打開大分子靶點蛋白與小分子配體的.mol2 格式，通過軟件中的AutoDock Vina 板塊，設置受體、配體分子及對接盒子大小，設定Number of binding modes=9、Exhaustiveness of search=8、Maximum energy difference=3，進行分子對接虛擬篩選，導出對接的最優(yōu)構象親和力分值結果。

2.6 QRF的體外炎癥活性驗證

2.6.1 QRF 水提物的制備 按照1.0∶1.5∶1.5 稱取珠子參、秦艽和山茱萸，加16 倍量水煎煮3 次，每次2 h，合并濾液，得QRF水提液，用時稀釋至對應質(zhì)量濃度。

2.6.2 QRF對RAW264.7細胞增殖的影響 RAW264.7細胞用含10% FBS 及1%青?鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞密度調(diào)整為2×105個/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板中，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 之后，棄去上清液，設對照組（完 全培養(yǎng)基）及QRF（20、50、100、200、500、1000、2000 μg·mL-1，以生藥量計）組，每組設置6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK?8試劑10 μL，1 h后用酶標儀在450 nm波長處檢測其吸光度。

2.6.3 QRF對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF?α的影響 將RAW264.7 細胞以2×105個/mL 的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h之后，棄上清液，設置對照組（完全培養(yǎng)基）、模型組（LPS 1 μg·mL-1）、QRF（20、50、100、200 μg·mL-1，以生藥量計）組，每組設置6 個復孔[14]。作用20 h 后取細胞上清液，按TNF?αELISA試劑盒說明書進行操作，檢測TNF?α釋放量。

2.6.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01軟件進行統(tǒng)計學分析。各組數(shù)據(jù)以（）表示。若符合正態(tài)性分布和方差齊性檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；若為非正態(tài)分布或方差不齊，兩組之間比較采用Mann?Whitney U 檢驗，多組間比較采用Kruskal?Wallis H檢驗。至少進行3次以上平行實驗。

3 結果

3.1 QRF活性成分的收集

經(jīng)TCMSP、SymMap、ETCM 數(shù)據(jù)庫及相關文獻[15?20]篩選，剔除無靶點預測數(shù)據(jù)的成分及藥物中含量少且非主要活性部位的成分，篩出珠子參活性成分33個、山茱萸中活性成分12個、秦艽中活性成分11個。

通過數(shù)據(jù)庫與文獻篩選出3 種藥物主要活性成分共50 個，結果見表1。其中齊墩果酸為3 種藥物共有的成分，谷甾醇、獐牙菜苷元為山茱萸、秦艽共有成分，豆甾醇為珠子參、山茱萸共有成分，胡蘿卜苷為珠子參、秦艽共有成分。

表1 QRF主要活性成分

3.2 藥物成分對應靶點及OA靶點的收集

共篩選得到珠子參靶點247 個、山茱萸靶點206個、秦艽靶點169個，去重后共計成分靶點330個。在GeneCards、Therapeutic Target Database、DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索分別得到OA 相關靶點466、20、82個，去重后共得到556 個靶點。通過韋恩圖對收集到的成分與疾病靶點進行交集（圖1），得到可能為QRF 中活性成分作用于OA的靶點26個。

圖1 QRF成分靶點與OA靶點交集韋恩圖

3.3 PPI網(wǎng)絡的構建

將26個靶點進行PPI分析，構建PPI網(wǎng)絡，見圖2。白細胞介素?6（IL?6）與其他蛋白的關聯(lián)程度最高，TNF、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、IL?1β等蛋白次之，說明這些蛋白參與調(diào)控的功能較為顯著。

圖2 QRF作用于OA靶點的PPI網(wǎng)絡

3.4 GO分析及KEGG通路富集分析

運用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫對26 個靶點進行GO生物學功能富集分析，共得到GO 條目762 個（P＜0.05），其中BP 條目672 個，CC 條目30 個，MF 條目60 個，分別占88%、4%、8%。3 個類別GO 分析P值較小的前10 個結果見圖3。由GO 分析結果可知，QRF 中的活性成分作用于OA 的靶點主要分布在細胞外空間（extracellular space）、細胞外區(qū)域（extracellular region）、核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB）抑制蛋白（I?κB）/NF?κB 復合體（I?κB/NF?κB complex）等部位，MF 主要涉及過渡金屬離子結合（transition metal ion binding）、血紅素結合（heme binding）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶活性（prostaglandin?endoperoxide synthase activity）、細胞因子活性（cytokine activity）等，且與細胞因子介導的信號通路（cytokine?mediated signaling pathway）、對細胞因子的反應（response to cytokine）、細胞對細胞因子刺激的反應（cellular response to cytokine stimulus）、炎癥反應（inflammatory response）等BP密切相關。

圖3 QRF干預OA靶點的GO富集分析

KEGG 代謝通路富集共篩選得到102 條信號通路（P＜0.05），涉及IL?17 信號通路（hsa04657）、TNF信號通路（hsa04668）、類風濕關節(jié)炎（hsa05323）、Toll 樣受體（TLR）信號通路（hsa04620）、輔助性T 細胞17（Th17）分化（hsa04659）、破骨細胞分化（hsa04380）等，這些通路可能為QRF 干預OA 的關鍵通路。P值較小的前10 條代謝通路對應靶點信息見表2。

表2 代謝通路對應靶點信息(前10條)

3.5 藥物?成分?靶點?通路網(wǎng)絡的構建

將KEGG 通路富集分析結果的前10 條代謝通路匹配的靶點進行整合，共得到通路關聯(lián)靶點14 個，通過2.1 項下的成分靶點整理得到14 個靶點分別對應的藥物活性成分，運用Cytoscape 3.7.2 軟件構建QRF藥物?成分?靶點?通路網(wǎng)絡（圖4）。

圖4 QRF干預OA的藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡

其中珠子參中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd，山茱萸中熊果酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷，秦艽中的馬錢苷酸、龍膽堿等多個成分的度（degree）值較高，提示這些活性成分可能參與了QRF調(diào)控干預OA的過程。

3.6 分子對接虛擬篩選

AutoDock Vina 對接后的score 表示配體受體對接的最佳構象打分值，數(shù)值越小說明配體與受體結合的親和力越大，構象越穩(wěn)定。一般認為score＜-7，配體受體具有強烈的結合活性。將網(wǎng)絡藥理學技術預測的靶點蛋白受體及活性成分的小分子配體結構進行能量最小化處理后，在Chimera 的AutoDock Vina 板塊進行虛擬對接，結果見表3。以陽性對照藥物塞來昔布對比評價預測的其他主要活性成分與目標靶點的結合能力。由分子對接結果可知，人參皂苷Rg1與TNF 親和力強于塞來昔布，熊果酸、人參皂苷Rb1與IL?1β，熊果酸與IL?6 親和力強于塞來昔布，人參皂苷Re 與IL?1β、IL?6 對接構象的親和力與塞來昔布相當。熊果酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、馬錢苷酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷與PTGS2 均有較強的結合活性，但弱于塞來昔布。

表3 QRF干預OA的活性成分與關鍵靶點對接得分及關聯(lián)藥物分析

上述靶點與部分活性成分的分子對接構象結果見圖5。大部分活性成分與受體主要以氫鍵形式結合，其中人參皂苷Rg1上羥基與TNF 蛋白上的GLU248、GLN369為氫鍵的結合位點，羰基與LYS238結合形成氫鍵。人參皂苷Rb1與IL?1β受體結合，配體上羥基與LEU134 為氫鍵結合位點。熊果酸與IL?6 受體上ASN33結合形成氫鍵。人參皂苷Rg1與PTGS2上氫鍵結合位點為THR28、ARG29、SER95、ILE93、SER90、GLN339。

圖5 QRF干預OA的活性成分與靶點對接相互作用分析

3.7 體外抗炎活性驗證結果

QRF 對RAW264.7 細胞增殖的影響結果見表4，與對照組相比，QRF 在1000 μg·mL-1時細胞存活率降低，在20～500 μg·mL-1可明顯促進細胞增殖，說明QRF 質(zhì)量濃度在500 μg·mL-1以下對RAW264.7細胞無細胞毒作用。因此，選取QRF質(zhì)量濃度為20、50、100、200 μg·mL-1進行LPS誘導炎癥模型實驗。

表4 QRF對RAW264.7細胞增殖的影響（,n=5）

表4 QRF對RAW264.7細胞增殖的影響（,n=5）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

QRF 的體外抗炎作用結果見表5。模型組細胞TNF?α的釋放量顯著高于對照組（P＜0.001）。與模型組相比，QRF 各給藥組對細胞TNF?α釋放量呈劑量依賴性降低，其中以QRF 200 μg·mL-1組最為顯著（P＜0.01）。由此可見，QRF 可抑制LPS 誘導的RAW264.7細胞中炎癥因子TNF?α的釋放。

表5 QRF對RAW 264.7細胞TNF-α分泌量的影響（,n=3）

表5 QRF對RAW 264.7細胞TNF-α分泌量的影響（,n=3）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

4 討論

OA為退行性關節(jié)疾病，不同于風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性狼瘡，OA不影響身體的其他器官。年齡、外傷、肥胖、發(fā)炎、勞損、遺傳、骨質(zhì)疏松及皮質(zhì)類固醇藥物治療致骨頭壞死等多種因素均可誘發(fā)OA。臨床中對于OA 的干預方式包括減輕體質(zhì)量、鍛煉、服用止痛藥或消炎藥、膝關節(jié)注射皮質(zhì)類固醇或透明質(zhì)酸、替代療法（外用辣椒素軟膏、針灸、補充劑包括葡萄糖胺和軟骨素）、外用支架及手術等[21]。使用的止痛藥及消炎藥多應用非甾體類抗炎藥物、阿片類鎮(zhèn)痛藥物、對乙酰氨基酚與阿片類復方制劑等[22?23]，但非甾體類抗炎藥物、阿片類藥物不良反應較明顯[23?24]，且使用時對患者的限制條件較多。中醫(yī)藥不良反應相對較小，通過藥物中的多種活性成分作用于多靶點進行干預，在OA 的治療過程中發(fā)揮了重要作用[25?26]。

本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法，預測得出QRF 可能通過人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、熊果酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷、馬錢苷酸、龍膽堿等活性成分，作用于IL?6、TNF、IL?1β、PTGS2等靶點，調(diào)控IL?17信號通路、TNF信號通路、類風濕關節(jié)炎、Th17 分化、Toll 樣受體信號通路、破骨細胞分化等信號通路實現(xiàn)對OA的干預。

研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞存在的前提下，IL?6 和可溶性IL?6 受體結合，增加破骨細胞形成、分化，從而刺激骨吸收[27]。IL?1 是與軟骨破壞息息相關的細胞因子，可促進金屬蛋白酶（MMPs）的生成，抑制金屬蛋白酶組織抑制因子?1（TIMP?1），使TIMP?1 與MMPs 處于失衡狀態(tài)，從而引起軟骨分解；另一方面，IL?1 又可刺激滑膜細胞生成、釋放脂質(zhì)類代謝物質(zhì)前列腺素E2（PGE2），引發(fā)滑膜炎癥，PGE2 反作用于IL?1，強化其對軟骨的分解。IL?1α和IL?1β是IL?1 的2 種不同的分子形式。在正常人軟骨細胞中，IL?1 僅存在于上層軟骨的個別細胞中，但是在OA 患者上層軟骨細胞及細胞外基質(zhì)均可見強陽性的IL?1α和IL?1β。IL?1β刺激軟骨細胞釋放MMP?1、MMP?3 及MMP?13，這3 種蛋白酶是軟骨破壞的關鍵調(diào)節(jié)因子，是與軟骨破壞息息相關的細胞因子[28]。已有研究在類風濕性關節(jié)炎患者的關節(jié)滑液中檢測到TNF?α，患者體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子，導致血中TNF?α、IL?6 增加，激活炎癥反應，表現(xiàn)出發(fā)熱、疼痛等一系列炎癥反應癥狀[29]。PTGS參與花生四烯酸代謝途徑。PTGS2作為前列腺素G/H合酶家族中的1 種誘導型同工酶，參與炎癥反應及前列腺素類的生物合成。以上文獻研究表明，IL?6、IL?1β、TNF?α、PTGS2 在炎癥、軟骨關節(jié)的病理生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

IL?17 是炎癥相關的細胞因子，與靶細胞上受體相結合，通過NF?κB途徑，誘導IL?1β、IL?6、TNF?α等促炎因子的產(chǎn)生，上調(diào)NO、MMPs等水平，引發(fā)自身免疫性疾病、炎癥反應等[30]。而IL?17 細胞因子為Th17 的主要效應因子，在人體自身免疫及機體抵御病原體等各種免疫反應中起重要作用[31]。TNF 在OA 患者的滑液、滑膜及軟骨中含量均顯著升高，TNF 可抑制軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白的合成，刺激MMP?1、MMP?3 和MMP?13 的釋放，誘導產(chǎn)生IL?6等活性因子[32]。類風濕性關節(jié)炎（RA）通路的活化可能參與骨破壞過程，文獻報道，RA 患者的免疫系統(tǒng)異常激活，體內(nèi)促炎因子、趨化因子水平升高，作用于滑膜成纖維細胞及成骨細胞，產(chǎn)生大量破骨細胞分化因子，影響破骨細胞的正常骨吸收；同時促炎因子升高致使滑膜成纖維細胞所釋放的MMP?1、MMP?3 等高表達，造成關節(jié)破壞[33]。有研究表明，TLR 依賴性途徑可激活NF?κB 和下游轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生各種破壞性介質(zhì)及自身抗體，從而導致骨關節(jié)功能性疼痛，結構性的軟骨、骨畸形等一系列變化，TLR 可能是OA 與疼痛間的模式識別受體[34]。破骨細胞的生成與NF?κB 受體激活子配體（RANKL）相關，炎癥性關節(jié)滑膜成纖維細胞產(chǎn)生大量的RANKL 及TNF?α、IL?1 類促炎因子，刺激破骨細胞生成，致使關節(jié)部位骨丟失，從而導致關節(jié)部位僵硬、關節(jié)變形，進而發(fā)展為OA[35]。本研究預測出與炎癥、關節(jié)疾病、破骨細胞分化相關的多條信號通路，可為QRF 干預OA 的相關研究提供參考。

珠子參的主要活性部位是珠子參總皂苷，其中人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1等多種單體化合物已被證實具有抗炎活性。據(jù)文獻報道，人參皂苷Re 能抑制LPS 與TLR4 結合，以及刺激小鼠腹腔巨噬細胞中NF?κB的激活，抑制炎癥因子TNF?α和IL?1β等的表達，減輕炎癥反應[36]。人參皂苷Rb1可通過抑制IL?6、IL?1β、環(huán)氧化酶?2（COX?2）、PGE2等炎癥介質(zhì)，對單碘乙酸（MIA）所致去卵巢OA 大鼠起到軟骨保護作用[37]。人參皂苷Rg1可劑量依賴性地抑制IL?1β誘導的人軟骨細胞中MMP?13、COX?2 和PGE2 的蛋白表達，并抑制Ⅱ型膠原降解，亦可減輕前交叉韌帶橫斷（ACLT）誘導的OA 大鼠軟骨退行性變[38]。熊果酸是山茱萸中一類三萜化合物，為山茱萸藥物中的主要抗炎活性化合物，研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可劑量依賴性抑制酵母聚糖誘導的小鼠急性炎癥氣囊滲出液中PGE2 的產(chǎn)生，還能防止卡拉膠對大鼠足跖水腫的影響及醋酸所致小鼠扭體現(xiàn)象，具有抗炎、鎮(zhèn)痛功能[39]。部分研究認為，熊果酸的抗炎機制與抑制脂氧合酶和環(huán)氧合酶活性、減少花生四烯酸級聯(lián)反應產(chǎn)生的炎癥因子密不可分[40]。山茱萸、秦艽中的活性成分獐牙菜苷元亦具有抗炎活性。Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)獐牙菜苷元可顯著抑制IL?1β誘導的大鼠關節(jié)軟骨細胞中PGE2的產(chǎn)生，降低MMP?1、MMP?3 和MMP?13 mRNA 的表達，同時能夠抑制IL?1β所誘導的NF?κB活化，推測其抗炎活性是通過抑制NF?κB 信號轉(zhuǎn)導介導的。龍膽堿為秦艽中主要活性成分，Kwak 等[42]研究發(fā)現(xiàn)龍膽堿可抑制LPS 誘導的雄性SD 大鼠血清中TNF?α、IL?6水平升高，從而減輕炎癥反應。

分子對接構象篩選結果顯示，網(wǎng)絡藥理學預測得到的活性成分與靶標蛋白結合親和力較強，說明QRF 中活性成分對OA 的干預可能通過調(diào)控TNF?α、IL?6、IL?1β、PTGS2 等相關因子實現(xiàn)。進一步通過QRF 干預炎癥模型的體外實驗驗證了其對炎癥因子TNF?α有明確的調(diào)節(jié)作用。結合上述相關文獻研究，證實這些活性化合物可以通過對體內(nèi)炎癥因子的調(diào)節(jié)，抑制炎癥反應進程。因此，通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術預測QRF 干預OA 具有一定的參考價值。

本研究仍存在一些不足之處：1）受限于網(wǎng)絡藥理學預測分析時使用的數(shù)據(jù)庫的時效性及全面性，可能存在成分及疾病靶點更新不及時、不全面現(xiàn)象，從而使得預測結果可能存在一定的誤差。2）在臨床治療中，中藥或制劑在體內(nèi)的相互作用機制尚不明確，無法將藥物相互作用及在體內(nèi)的反應納入研究分析。3）網(wǎng)絡藥理學技術及分子對接技術用于初步的預測、篩選，其結果還需實驗驗證。后續(xù)課題組將在本課題的研究基礎上，進一步對預測的結果進行驗證。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術及體外實驗驗證，預測得出QRF 主要可能通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)等過程，發(fā)揮多靶點、多通路干預OA的作用，為QRF干預OA提供理論支撐。