劉 順，翁歆之，鄭曉葉，黃 培，賀 潔，鄭青松*

(1.浙江省玉環(huán)市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江玉環(huán) 317600；2.浙江省臺(tái)州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江臺(tái)州 318000； 3.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310023)

臺(tái)州地區(qū)是浙江省凡納濱對(duì)蝦的重要養(yǎng)殖區(qū)，近年來，對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中各類病害頻發(fā)嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)貙?duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的病原有對(duì)蝦白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus,VP)和蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)。對(duì)蝦白斑病毒和高致病性副溶血弧菌往往發(fā)病迅速并造成大量死亡，傳染性皮下和造血器官壞死病毒和蝦肝腸胞蟲則會(huì)引起對(duì)蝦生長緩慢、規(guī)格參差不齊，這4種病原引起的疫病暴發(fā)會(huì)造成對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。為了解凡納濱對(duì)蝦4種病原在臺(tái)州地區(qū)的感染情況，對(duì)2017年-2019年該地區(qū)收集的337個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行4種病原的感染情況檢測(cè)，總結(jié)4種病原在該地區(qū)的感染和流行情況，以期為此類疫病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2017年-2019年每年5月～9月從浙江臺(tái)州地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)和淡水養(yǎng)殖區(qū)采集凡納濱對(duì)蝦蝦苗及中成蝦，蝦苗規(guī)格0.8 cm～1.5 cm，采集樣品量不少于200尾；中成蝦規(guī)格5.0 cm～12.0 cm，取鰓、肝胰腺、腸道和尾部肌肉混合，樣品保存于950 mL/L乙醇中備用。不同養(yǎng)殖方式、不同規(guī)格對(duì)蝦分年份采集樣品組成見表1。

1.1.2 主要試劑與儀器 海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Taq酶和DL 2 000 Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將保存于950 mL/L乙醇中的樣品取出，先用雙蒸水潤洗1次，再用無菌濾紙吸去多余水分，取適量樣品用于基因組DNA提取，按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，DNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測(cè) WSSV、IHHNV檢測(cè)引物參照文獻(xiàn)[1]中規(guī)定的檢測(cè)引物，EHP檢測(cè)引物參考文獻(xiàn)[2]，AP檢測(cè)引物參考文獻(xiàn)[3](表2)。PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR buffer(Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，TakaraTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，模板DNA 2 μL，滅菌水34.75 μL，各組分充分混勻后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照，對(duì)比陽性對(duì)照電泳條帶位置，擴(kuò)增片段與陽性對(duì)照片段位置一致則判定為陽性，并將陽性樣品PCR產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1 對(duì)蝦樣品組成

表2 引物序列信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 排除病原混合攜帶情況，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不考慮病原混合攜帶情況而單獨(dú)計(jì)數(shù)。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)，以P<0.05表示相關(guān)性顯著，P<0.01表示相關(guān)性極顯著。氣象數(shù)據(jù)來自臺(tái)州市氣象局。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖對(duì)蝦各病原攜帶情況

2017年-2019年4種病原總體攜帶率EHP>IHHNV>AP>WSSV(表3)。不同年份養(yǎng)殖對(duì)蝦WSSV、IHHNV、AP、EHP 4種病原的攜帶率分別為2017年1.98%、36.64%、7.92%、51.49%；2018年4.03%、23.39%、4.84%、45.97%；2019年0、29.46%、10.71%、27.68%。檢測(cè)的4種病原2017年和2018年攜帶率均為EHP>IHHNV>AP>WSSV，2019年為IHHNV>EHP>AP>WSSV。2017年-2019年臺(tái)州地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦不同年份EHP的攜帶情況差異極顯著(P<0.01)，且不同年份EHP攜帶率呈逐年下降趨勢(shì)；不同年份WSSV、IHHNV和AP的攜帶情況均無顯著差異(P>0.05)，同時(shí)3種病原不同年份的攜帶情況變化趨勢(shì)亦均不明顯(圖1)。

圖1 2017年-2019年各病原攜帶趨勢(shì)變化

2.2 不同規(guī)格養(yǎng)殖對(duì)蝦病原攜帶情況

2017年-2019年IHHNV、AP和EHP在蝦苗和中成蝦中總體攜帶率較為一致，均為蝦苗>中成蝦，WSSV攜帶率則為中成蝦>蝦苗。不同年份EHP在蝦苗和中成蝦中攜帶率均為蝦苗>中成蝦，IHHNV和AP則在2017年和2018年為蝦苗>中成蝦，2019年為蝦苗<中成蝦。不同年份IHHNV在蝦苗和中成蝦中攜帶情況差異顯著(P<0.05)；不同年份EHP在蝦苗和中成蝦中攜帶情況差異極顯著(P<0.01)；而不同年份WSSV和AP分別在蝦苗和中成蝦中攜帶情況則均無顯著差異(P>0.05)(表4)。

表3 2017年-2019年4種病原檢測(cè)總體情況

表4 4種病原在蝦苗與中成蝦中檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同養(yǎng)殖水體對(duì)蝦病原攜帶情況

2017年-2019年不同年份IHHNV和AP攜帶率均呈現(xiàn)出海水>淡水，但不同年份IHHNV在海水與淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦的攜帶情況差異顯著(P<0.05)，AP的攜帶情況無顯著差異(P>0.05)；EHP攜帶率2017年海水養(yǎng)殖對(duì)蝦略高于淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦，2018年和2019年則均為淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦>海水養(yǎng)殖對(duì)蝦，但各年份海、淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦無顯著差異(P>0.05)；WSSV總體攜帶率為淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦>海水養(yǎng)殖對(duì)蝦，其中2017、2018年攜帶率均為淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦>海水養(yǎng)殖對(duì)蝦，2019年則未檢出陽性樣品，各年份海、淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦無顯著差異(P>0.05)(表5)。

2.4 不同病原混合攜帶情況

對(duì)2017年-2019年全部337份樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)到4種病原混合攜帶樣品共41例，其中二重病原攜帶檢出4個(gè)類型共38例，IHHNV+EHP攜帶率最高，陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為29/8.61%；其次為AP+EHP，對(duì)應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為5/1.48%，WSSV+IHHNV和IHHNV+AP的攜帶率較低，對(duì)應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為2/0.59%、2/0.59%。三重病原攜帶檢出2個(gè)類型共3例，分別為WSSV+IHHNV+EHP、IHHNV+EHP+AP，對(duì)應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為1/0.30%、2/0.59%，未檢測(cè)到其他混合攜帶情況。

2.5 各病原攜帶與環(huán)境因子的關(guān)系

通過對(duì)2017年-2019年5月～9月的月平均降水量、月平均氣溫與各病原攜帶率的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各病原攜帶率與月平均降水量無明顯相關(guān)性，月平均氣溫則與IHHNV和AP均呈顯著正相關(guān)(表6)，說明氣溫顯著影響IHHNV和AP的發(fā)生。

表5 海水、淡水不同養(yǎng)殖水體檢測(cè)結(jié)果

表6 環(huán)境因子與各病原攜帶率相關(guān)性

3 討論

2017年-2019臺(tái)州地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦WSSV、IHHNV、AP、EHP 4種病原中EHP的總體攜帶率最高，達(dá)到41.54%，其蝦苗攜帶率高達(dá)55.56%。IHHNV為第2高攜帶率的病原，與全省蝦苗IHHNV攜帶情況相比[4]，臺(tái)州地區(qū)蝦苗IHHNV攜帶率明顯高于全省整體水平，說明當(dāng)?shù)谽HP和IHHNV的流行較為嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)2種病原的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和防控工作。AP是2010年新確認(rèn)病原[5]，2013年-2016年浙江省養(yǎng)殖對(duì)蝦副溶血弧菌源AP毒力因子的攜帶率為10.34%[6]，遠(yuǎn)低于調(diào)查的8個(gè)省市的平均水平33.11%，說明該病原在浙江省內(nèi)的流行范圍有限。

4種病原中EHP、IHHNV和AP在蝦苗中的攜帶率高于中成蝦。成蝦比小規(guī)格蝦的EHP感染率更高[7]，本研究發(fā)現(xiàn)蝦苗EHP攜帶率更高。臺(tái)州地區(qū)對(duì)蝦苗種來源于福建、廣東、海南等地區(qū)，蝦苗在放養(yǎng)之前已攜帶病原的風(fēng)險(xiǎn)較高，此外，剛放養(yǎng)的蝦苗受水質(zhì)環(huán)境改變影響也更容易感染病原。WSSV在蝦苗和中成蝦中的攜帶率都較低。本次調(diào)查臺(tái)州地區(qū)養(yǎng)殖蝦苗和中成蝦的WSSV攜帶率均低于全省水平，說明近幾年WSSV攜帶率整體呈下降趨勢(shì)。

對(duì)蝦WSSV、IHHNV、EHP等病原分別與自然海區(qū)和養(yǎng)殖環(huán)境中的甲殼類[8]、貝類[9]、豐年蟲[10]以及藻類[11]之間等存在交叉感染，AP因在水體環(huán)境、沉積物中含量豐富，當(dāng)環(huán)境改變或被攝食也更容易成為條件致病菌感染養(yǎng)殖對(duì)蝦。相比較其他幾種病原，本研究發(fā)現(xiàn)IHHNV在海水養(yǎng)殖對(duì)蝦中攜帶率高于淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦，說明鹽度對(duì)IHHNV感染對(duì)蝦具有一定影響，與文獻(xiàn)[12]結(jié)果相反。臺(tái)州溫嶺、玉環(huán)、三門等地作為蝦貝混養(yǎng)的重要地區(qū)，不同生物間病原存在交叉感染、垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)，以及養(yǎng)殖過程中環(huán)境改變、餌料質(zhì)量、日常管理等問題也是對(duì)蝦IHHNV高攜帶率的重要原因。

本研究中的4種病原均有混合攜帶情況，包括4種二重病原攜帶類型和2種三重病原攜帶類型，在所有混合病原攜帶情況中IHHNV+EHP的混合攜帶率最高，三重病原攜帶類型相對(duì)較少。各病原混合攜帶樣品數(shù)在所有該病原陽性樣品中比例分別為WSSV 42.86%、IHHNV 36.36%、AP 34.62%、EHP 26.43%，可知WSSV陽性樣品中混合攜帶比例較高，而IHHNV則在6種混合攜帶類型中占5種，說明IHHNV混合攜帶情況更為普遍。目前研究報(bào)道對(duì)蝦病原混合攜帶的類型有WSSV+IHHNV[13]、IHHNV+EHP[14]、EHP+AP[15]。也檢測(cè)到目前尚未報(bào)道的類型，反映出臺(tái)州地區(qū)病原混合攜帶類型較復(fù)雜。

IHHNV的流行與溫度有中度相關(guān)性[16]，AP在低溫季節(jié)養(yǎng)殖對(duì)蝦患病機(jī)率低于高溫季節(jié)[17]，與本研究結(jié)論相一致。

臺(tái)州地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦4種病原的攜帶存在不同程度的流行情況，各病原的攜帶主要與蝦苗水平傳播、養(yǎng)殖環(huán)境因子改變誘發(fā)等有關(guān)。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中各病害的發(fā)生應(yīng)以預(yù)防為主，蝦苗應(yīng)選用SPF苗種、合理控制放養(yǎng)密度、適時(shí)調(diào)節(jié)水質(zhì)、科學(xué)合理投餌等手段預(yù)防疫病發(fā)生。對(duì)于WSSV、IHHNV等病毒性疾病目前尚無特效藥，應(yīng)從加強(qiáng)親本、苗種、幼蝦、成蝦全鏈條的檢疫檢測(cè)入手進(jìn)行有效防控，AP、EHP等疫病的防控應(yīng)注重養(yǎng)殖前期環(huán)境的管理，同時(shí)可合理使用漁用標(biāo)準(zhǔn)藥物防治。