張琳慧，蘇夢茹，王 卓，王 娟

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100)

抗生素廣泛使用導致細菌耐藥問題日趨嚴重，細菌耐藥性成為21世紀人類和養(yǎng)殖業(yè)的最大威脅之一[1]。如攜帶抗多黏菌素基因mcr(mcr1-9)的大腸埃希氏菌等不斷被報道，甚至在臨床培養(yǎng)的大腸埃希氏菌菌株上也分離出來mcr-1基因。細菌對于多黏菌素的耐藥性被認為是與染色體突變有關，而由質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1可在同一菌種或不同菌種間水平傳播。研究mcr-1基因的來源特征與抗多黏菌素耐藥機制之間的關系，對評估m(xù)cr-1基因的傳播和深入研究耐藥菌的耐藥機制和存活方式有參考價值。

1 mcr基因特征及其介導的耐藥機制

1.1 mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)及分布

當微生物長期暴露于不同抗生素下，細菌的基因容易發(fā)生突變，即產(chǎn)生抗菌抗性(AMR)。對腸埃希氏菌科細菌耐多黏菌素研究中，部分耐藥菌株卻未測得耐藥基因(pmrAB,phoPQ和mgrB)陽性，在進一步接合轉化試驗中質粒的轉移使受體菌獲得多黏菌素耐藥性，對該質粒進行全序列測序，并命名為mcr-1，它是一種質粒介導腸桿菌科細菌免受黏菌素的侵害，改變細菌對抗生素敏感性的基因[2]。細菌的耐藥性產(chǎn)生是通過染色體突變的形式，由于染色體突變的隨機性，耐藥菌在理論上不會出現(xiàn)大規(guī)模的增殖和富集，而mcr-1基因被發(fā)現(xiàn)后，該基因是由質粒介導在菌群間水平傳播，極大地增加了耐藥性傳播的風險性[3]。mcr-1的發(fā)現(xiàn)引起世界各國對該基因的重視，有38個國家/地區(qū)分離出mcr-1陽性樣品，有的國家/地區(qū)已發(fā)現(xiàn)mcr-1的變異體mcr-2；非洲有突尼斯、埃及、阿爾及利亞、尼日利亞和南非；北美洲的加拿大和美國，南美洲阿根廷、厄瓜多爾和巴西以及澳大利亞等國家也有mcr-1的報道[4]。

對豬場糞便樣品耐藥菌株檢測中發(fā)現(xiàn)122份樣品有86株耐藥菌株，經(jīng)PCR檢測出63株mcr-1陽性菌株(均為大腸埃希氏菌)[5]，耐藥發(fā)生率和mcr-1陽性率分別高達70%和51%。豬場中高耐藥發(fā)生率說明抗生素的濫用已經(jīng)引起了嚴重的細菌耐藥問題，豬場檢測樣品mcr-1基因高陽性率表明豬場很可能是此耐藥基因的發(fā)源地，并且豬場生產(chǎn)過程中已經(jīng)有一定程度的流行，大腸埃希氏菌是其傳播的主要載體，可實現(xiàn)不同親緣關系菌株間的傳播。鑒于豬場的mcr-1基因的廣泛流行和傳播，進一步對豬場相關產(chǎn)品的流向線索分析，監(jiān)測動物產(chǎn)品，貫穿豬場的水源，污水廢水以及周圍土壤m(xù)cr-1基因的陽性率，結果顯示在豬場的各個環(huán)節(jié)中已經(jīng)有大量的mcr-1基因，且泥土中含量較大[6]。說明動物體內(nèi)大腸埃希氏菌攜帶的mcr-1基因已經(jīng)向周圍環(huán)境擴散，且可長時間積聚于環(huán)境中。由于豬場mcr-1基因的流行情況，在其他畜產(chǎn)品生產(chǎn)過程中也應定期監(jiān)測mcr-1耐藥基因的陽性率，重點監(jiān)測流動性較差的相關物品，分析比對數(shù)據(jù)，追溯耐藥性傳播的源頭，做好污水污物無害化處理，延緩耐藥性的傳播和發(fā)展。

1.2 mcr-1基因的序列多樣性及其變異體

mcr-1基因全長1 626 bp,G+C含量49%。預測該基因編碼mcr-1蛋白，由N-末端的5個跨膜域和催化域組成，跨膜區(qū)和底物結合位點作用從而改變菌株的耐藥特性[4]。在mcr-1基因的研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的多黏菌素耐藥基因mcr-2，與mcr-1一致性為76.75%，其序列的基因環(huán)境也非常相似，同樣插有插入元件IS1595超家族和297 bp的開放閱讀框(ORFs)編碼以及與mcr-1基因編碼蛋白相似的蛋白[7]。mcr-3、mcr-1和mcr-2僅有45.0%和47.0%的核酸序列和氨基酸序列一致性。但在多黏菌素耐藥性表達上mcr-1變異體與mcr-1無明顯差別[8]。mcr-3發(fā)現(xiàn)不久，mcr-4也被發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種mcr家族基因(mcr-1～mcr-10)[9]，作為mcr-1的變異體，其在細菌間水平傳播和引起多黏菌素耐藥性也應引起注意。

1.3 mcr-1的傳播及耐藥機制

該基因突破了人們對細菌耐藥性主要由染色體突變引起的認知，其在不同菌株之間基因轉移方式也不同，mcr-1由可攜帶基因質粒所介導轉移或是僅其上游序列單獨轉移。mcr-1基因主要位于IncI2、IncI1、IncHI2、IncHI1、Incp、IncX4、IncFI、IncFII、IncN和IncK等不相容分型的細菌質粒上，以IncI2和IncK最為常見[4]。mcr-1由宿主質粒介導傳播，可通過接合試驗或者轉化試驗將大腸埃希氏菌中的mcr-1轉移到其他菌株，接合子的MIC值在某些菌株上可能也會出現(xiàn)變化，mcr-1基因既可在腸桿菌科中傳播，也可傳播到腸桿菌科外的細菌，基因水平上可以在大部分自然界微生物中移動和通過生物鏈傳播，導致多黏菌素耐藥率增加。

多黏菌素是陽離子多肽，包括5種化學結構不同的復合物(多黏菌素A～E)[4]。其作用機制主要是與革蘭氏陰性菌外膜中帶有負電荷的脂多糖(LPS)相互作用破環(huán)細菌細胞，而多黏菌素耐藥大多數(shù)與LPS的修飾有關，以前認為耐藥性是染色體突變引起，是由染色體介導的雙分組信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)失調(diào)(如PrmABh和phoPQ)及其特異性突變引起[10]。直到發(fā)現(xiàn)了質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1具有與細菌內(nèi)磷酸乙醇胺轉移酶家族相似活性，磷酸乙醇胺基團(PEtN)可以在其轉移酶的作用下轉移到LPS的類脂A上，其編碼的mcr-1蛋白跨膜域能夠固定于細胞內(nèi)膜并且一定程度上改變細胞膜的構象，在細胞周質中也可以完成對LPS的共價修飾，導致LPS的凈負電荷降低使細菌與帶正電的多黏菌素靜電作用降低，引起耐藥性的發(fā)生[11]。

2 mcr-1基因的陽性率與動物和環(huán)境的關系

mcr-1基因多由大腸埃希氏菌攜帶，在多個國家(地區(qū))多種樣品中檢測到mcr-1陽性，樣品來源包括人和其他動物腸道、排泄物、動物性食品(肉、牛奶及乳制品等)，動物生產(chǎn)排放的污水、廢水、各地河流土壤、海洋、水產(chǎn)養(yǎng)殖、多種新鮮蔬菜及糧食生產(chǎn)的不同階段。mcr-1已廣泛存在于環(huán)境中。

2.1 動物及動物產(chǎn)品mcr-1基因的高發(fā)生率

在比利時的一項研究中分析了多種動物源的大腸埃希氏菌耐藥分離株[12]，100%的分離株至少攜帶1個可移動性mcr基因(mcr-1～mcr-9)，其中mcr-1基因最常見。在1個小牛犢分離株同時檢測到了3種mcr基因(mcr-1、mcr-3和mcr-5)，并且3種基因由3種不同的質粒攜帶，該分離株對12種抗生素具有耐藥性。如果該菌株在醫(yī)學臨床引起致病性，將存在極大的潛在醫(yī)療風險。在對比來自于不同地域的4株分離株mcr-1圖譜時，mcr-1基因沒有表現(xiàn)顯著的克隆性，但對其相似的多黏菌素的抗藥性分析，可能是mcr-1基因部分序列控制對多黏菌素的耐藥性，在水平傳播中發(fā)生基因重組現(xiàn)象，也有可能出現(xiàn)基因突變產(chǎn)生基因差異。mcr-1基因突變讓人擔憂其他更嚴重的未知耐藥性的產(chǎn)生，在發(fā)現(xiàn)耐藥菌株時最好進行全序列測序，監(jiān)測mcr-1基因的同時也應關注mcr-1相似序列基因及其表達產(chǎn)物，是否對其他抗生素出現(xiàn)耐藥性?？捎捎H緣關系較遠的大腸埃希氏菌中不同質粒(對于mcr-1)所介導，也印證了mcr-1基因可在不同科屬間水平傳播，該基因如何在不同質粒間轉移值得進一步研究。

有報道從78%的生牛肉和53%的即食牛肉中分離出了大腸埃希氏菌，3.8%菌株帶有mcr-1基因[13]。mcr-1基因已經(jīng)存在動物食品中，食品污染途徑主要有兩種，環(huán)境污染和本身攜帶有該種細菌。由于發(fā)展中國家抗生素監(jiān)管機制和屠宰環(huán)境衛(wèi)生保證較發(fā)達國家有待改善，更應加強對mcr-1的檢測。全球一體化的發(fā)展和物流貿(mào)易，動物產(chǎn)品大范圍流通使耐藥基因成了一個全球性問題。在中國一例腹瀉兒童中發(fā)現(xiàn)與其他區(qū)域高度同源的mcr-1基因[14]，這說明該基因已經(jīng)實現(xiàn)跨區(qū)域傳播，未來在進出口貿(mào)易中應更加深入監(jiān)測。

在檢查一批初產(chǎn)沒有乳腺炎病史的荷斯坦奶牛時[15]，取20頭奶牛的牛奶樣品并觀察乳頭皮膚微生物菌群，分離培養(yǎng)出大量的革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌是mcr-1基因的良好載體。乳頭皮膚分離培養(yǎng)出大量的革蘭氏陰性菌說明在牛乳制品中也存在同種細菌，全球每年都要消耗數(shù)以億噸的牛奶，如果牛奶作為耐藥基因從動物傳播到人，其流行規(guī)模將難以控制。雖然目前尚未在牛乳制品中檢測到mcr-1，但分離出大量革蘭氏陰性菌，在之后的生產(chǎn)中還需要密切關注檢測牛乳制品的微生物含量。

在孟加拉國家禽腸道中也檢測到mcr-1基因[16]。在多個國家(地區(qū))無論是活體動物、食用動物和動物產(chǎn)品中，都檢測出了mcr-1基因，表明其已經(jīng)在動物及其相關產(chǎn)品中傳播，進一步也會通過食物傳播給人類[17]，人們在食用了這種食品后如果引發(fā)耐藥菌株感染，多黏菌素也即將失效，將面臨無藥可用的地步。

2.2 mcr-1陽性基因在自然環(huán)境中的分布

mcr-1陽性基因在污水廢水中存在比較集中[18]。在中國臺灣對淡水系統(tǒng)mcr-1陽性大腸埃希氏菌分布的研究中[19]，分別在不同區(qū)域采樣發(fā)現(xiàn)mcr-1陽性大腸埃希氏菌占5.9%，約71%陽性樣品來自河的下游地區(qū)，陽性分布率與中國臺灣沿河地區(qū)的畜禽密度顯著有關。中國臺灣的自然環(huán)境已經(jīng)被mcr-1陽性細菌所污染，耐藥菌株的分布與家畜種群密度呈正相關，表明河流中mcr-1陽性大腸埃希氏菌的污染很有可能來源于人為活動，是存在于畜群中的mcr-1基因向周圍環(huán)境傳播或者未經(jīng)無害化處理的養(yǎng)殖污水廢水導致了河流的污染。對河流分離細菌株進一步分析，對攜帶河流菌株mcr-1基因的質粒與畜禽養(yǎng)殖場中分離的mcr-1基因的質粒進行測序比較，4種細菌抗性是同一種質粒編碼，2種不同來源的質粒表現(xiàn)出了顯著的相似性，表明自然環(huán)境中的mcr-1基因是來源畜禽養(yǎng)殖。

2.3 mcr-1基因在食物鏈中的傳播

畜禽養(yǎng)殖場是mcr-1基因的發(fā)源地，養(yǎng)殖場產(chǎn)生的排泄物、廢水進入土壤引起水源污染，該基因可通過水資源積聚于植物中，進而擴散到草食動物和肉食動物中，最終傳播到人類。若不加以控制，mcr-1基因可通過食物鏈的傳播，遍及植物、動物和自然環(huán)境，導致生態(tài)系統(tǒng)更大范圍內(nèi)細菌耐藥性。在中國的一項常規(guī)監(jiān)測中[20]，從豬肉產(chǎn)品中分離出了一種高度可轉移的質粒介導的大腸埃希氏菌抗性基因mcr-1，與臨床住院的患者分離出的耐藥株進行測序比較，發(fā)現(xiàn)其中有1%帶有這種新的耐藥基因。表明動物源mcr-1基因已經(jīng)通過食物鏈的傳播導致了臨床病例耐藥性的發(fā)生。

3 mcr-1基因的傳播風險和遏制策略

3.1 mcr-1耐藥基因流行風險

mcr-1陽性基因已經(jīng)在我國養(yǎng)殖場中廣泛流行，其中以質粒介導的水平傳播為主[21]。mcr-1基因以質粒為載體實現(xiàn)基因水平上微生物內(nèi)的廣泛傳播，通過食物鏈可以在動植物以及人類大范圍流行，具有比其他耐藥性更大的流行風險?？股卦?jīng)作為人類對抗細菌最有效的手段之一，而今耐藥基因嚴峻的流行情況，導致未來的抗生素可能無法再發(fā)揮其顯著的效果，在面臨耐藥菌株感染時將會出現(xiàn)無藥可用的地步。

3.2 應對策略

3.2.1 控制獸醫(yī)臨床抗生素使用量 禁止黏菌素作為生長促進劑使用后[22]，多黏菌素預混物使用量下降，豬和禽的養(yǎng)殖場中耐碳青霉烯大腸埃希菌病顯著下降，人類感染中分離的耐碳青霉烯大腸埃希菌也明顯降低。表明控制畜牧生產(chǎn)中抗生素的使用量十分有必要。因此，國家應及時嚴格控制抗生素的使用量，降低耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.2.2 加強對抗生素的區(qū)域使用監(jiān)測 掌握抗生素使用的合理數(shù)據(jù)十分有必要，以區(qū)域抗生素使用數(shù)據(jù)預估常見菌的耐藥趨勢，為降低耐藥性的發(fā)生采取適當?shù)母深A措施。同時探索經(jīng)濟的抗生素殘留物處理措施加以推廣，可以有效的減少耐藥基因從動物向環(huán)境的傳播，在一定程度上也阻斷了耐藥基因通過生物鏈傳播。

3.2.3 防止感染 對當?shù)氐谋O(jiān)測數(shù)據(jù)進行合理的臨床評估，制定合理的藥物使用方案，減少疾病的發(fā)生，防止人類和動物的感染，從根源上減少抗生素的使用。

4 展望

隨著抗生素使用耐藥性問題日趨復雜，抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的防線也即將“失守”。人們首次發(fā)現(xiàn)了質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1及其變異體，對其來源、結構、傳播機制、耐藥機制以及對人類、動物和環(huán)境的影響進行了探究。本文就mcr基因的發(fā)現(xiàn)分布及其傳播和引起多黏菌素耐藥性的機制，與人、動物環(huán)境的關系和傳播風險等研究進展簡要綜述，以期對多黏菌素耐藥性的認識和mcr基因的研究提供參考。