張 峰，王正榮，蔣建軍，薄新文，張艷艷*，賈春英

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000； 2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000 ；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆圖木舒克 843900)

梨形蟲(chóng)病(Piroplasmosis)是一類(lèi)經(jīng)硬蜱傳播、由巴貝斯屬(Babesia)和泰勒屬(Theileria)原蟲(chóng)所引起的血液原蟲(chóng)病的總稱[1]，主要引起宿主貧血消瘦、黃疸高熱、血紅蛋白尿等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致宿主死亡[2]。梨形蟲(chóng)種類(lèi)繁多，全球記載的各種哺乳動(dòng)物巴貝斯蟲(chóng)有67種[3]，泰勒蟲(chóng)有13種[4]，其中對(duì)牛危害最大的是雙芽巴貝斯蟲(chóng)(B.bigemina)、牛巴貝斯蟲(chóng)(B.bovis)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和小泰勒蟲(chóng)(T.parva)[5]。硬蜱在梨形蟲(chóng)的傳播中起到了關(guān)鍵作用，在已發(fā)現(xiàn)的9屬硬蜱中有4屬被證明可作為牛梨形蟲(chóng)病的傳播媒介。在巴貝斯蟲(chóng)方面，牛巴貝斯蟲(chóng)的媒介蜱有篦子硬蜱(Ixodesricinus)、微小牛蜱(Boophilusmicroplus)、囊形扇頭蜱(R.bursa)等。微小牛蜱被證實(shí)是雙芽巴貝斯蟲(chóng)和牛巴貝斯蟲(chóng)的傳播媒介，鐮形扇頭蜱(R.haemaphysaloides)不僅可以傳播牛巴貝斯蟲(chóng)，還可以傳播東方巴貝斯蟲(chóng)(T.orientalis))，長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalislongicornis)可傳播卵形巴貝斯蟲(chóng)(B.ovata)。在泰勒蟲(chóng)，已確定有4種媒介蜱是環(huán)形泰勒蟲(chóng)的傳播者，即殘緣璃眼蜱(H.detritum)、小亞璃眼蜱、嗜駝璃眼蜱(H.dromedarii)、盾糙璃眼蜱(H.scuperse)。東方泰勒蟲(chóng)是由長(zhǎng)角血蜱、青海血蜱(H.qinghaiensis)、日本血蜱(H.japonica)傳播。青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱也可傳播瑟氏泰勒蟲(chóng)(T.sergenti)。本研究旨在調(diào)查小海子墾區(qū)媒介蜱及其攜帶梨形蟲(chóng)的種類(lèi)，查明該區(qū)域梨形蟲(chóng)種群分布。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年5月～7月，在新疆小海子墾區(qū)及周邊7個(gè)采樣點(diǎn)(紅旗農(nóng)場(chǎng)、伽師總場(chǎng)、44團(tuán)、46團(tuán)、49團(tuán)、50團(tuán)、51團(tuán))共采集524只硬蜱，均為璃眼蜱屬和扇頭蜱屬。

1.1.2 主要試劑與儀器 DAN提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，Takara公司產(chǎn)品；普通顯微鏡，北京瑞科中儀科技有限公司產(chǎn)品；Nikon三目顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司產(chǎn)品；DS-Filc數(shù)字?jǐn)z像系統(tǒng)，上海普赫光電科技有限公司產(chǎn)品；96梯度PCR儀和凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及形態(tài)學(xué)鑒定 將采集的硬蜱放入沸水中停留5 s，使其肢體展開(kāi)，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗體表異物，放入含有甘油的750 mL/L酒精中，置-20℃保存。參照文獻(xiàn)[6-7]對(duì)硬蜱在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 硬蜱基因組DNA的提取 在提取硬蜱DNA前，用500、300、100 mL/L酒精分別浸泡1 h，再用蒸餾水浸泡1 h，盡可能將硬蜱剪碎。按照DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。

1.2.3 梨形蟲(chóng)18S rRNA基因擴(kuò)增 引物參照文獻(xiàn)[8-9]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。巴貝斯蟲(chóng)反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。泰勒蟲(chóng)反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。最后取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(表1)。

表1 引物序列及目的片段長(zhǎng)短

1.2.4 序列測(cè)定與分析 將PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，通過(guò)Blast進(jìn)行基因的同源序列比對(duì)。用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，最后用MEGA7軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其自展值檢驗(yàn)為1 000。

2 結(jié)果

2.1 硬蜱形態(tài)學(xué)鑒定

在新疆小海子墾區(qū)及周邊地區(qū)7個(gè)采樣點(diǎn)采集到524只硬蜱，在光學(xué)顯微鏡下初步鑒定為璃眼蜱屬和扇頭蜱屬，共5種，包括小亞璃眼蜱293只(55.92%)、亞洲璃眼蜱100只(19.08%)、圖蘭扇頭蜱79只(15.08%)、麻點(diǎn)璃眼蜱47只(8.97%)，血紅扇頭蜱5只(0.95%)(圖1～圖5)。

圖1 小亞璃眼蜱鑒定結(jié)果

圖2 亞洲璃眼蜱鑒定結(jié)果

2.2 硬蜱體內(nèi)梨形蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

用2對(duì)梨形蟲(chóng)18S rRNA特異性引物，對(duì)小海子墾區(qū)及周邊地區(qū)所采集的524只硬蜱進(jìn)行PCR檢測(cè)，共檢測(cè)出69份陽(yáng)性樣品，總陽(yáng)性率為13.17%。其中小亞璃眼蜱采集數(shù)目最多，牛梨形蟲(chóng)感染率也最高，為23.21%，其次為圖蘭扇頭蜱，為1.27%。而本次所采集的亞洲璃眼蜱、麻點(diǎn)璃眼蜱、血紅扇頭蜱均未檢測(cè)出牛梨形蟲(chóng)。因此可確定小亞璃眼蜱和圖蘭扇頭蜱攜帶梨形蟲(chóng)(表2)。

圖3 圖蘭扇頭蜱鑒定結(jié)果

圖4 麻點(diǎn)璃眼蜱鑒定結(jié)果

圖5 血紅扇頭蜱鑒定結(jié)果

表2 硬蜱體內(nèi)牛梨形蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

2.3 硬蜱體內(nèi)牛梨形蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

524只硬蜱共檢出69份陽(yáng)性樣品,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示,69份陽(yáng)性樣品中有67份為環(huán)形泰勒蟲(chóng)，其余2份為綿羊泰勒蟲(chóng)和隱藏巴貝斯蟲(chóng)。環(huán)形泰勒蟲(chóng)、隱藏巴貝斯蟲(chóng)為小亞璃眼蜱攜帶，綿羊泰勒蟲(chóng)為圖蘭扇頭蜱攜帶。泰勒蟲(chóng)株目的片段約1 530 bp，巴貝斯蟲(chóng)株目的片段約1 300 bp(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.陽(yáng)性樣本；5～6.陽(yáng)性對(duì)照；7.陰性對(duì)照

2.4 硬蜱體內(nèi)牛梨形蟲(chóng)序列分析

將已測(cè)序的牛梨形蟲(chóng)18S rRNA目的片段，與GenBank上注冊(cè)的牛梨形蟲(chóng)18S rRNA序列比較，檢測(cè)出的兩種泰勒蟲(chóng)與GenBank上發(fā)表的泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)種序列同源性≥97%。以牛巴貝斯蟲(chóng)未定種新疆株(Babesiasp.Xinjiang，XM029015910)作為外類(lèi)群，用MEGA7軟件，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)本文在硬蜱體內(nèi)檢測(cè)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)與環(huán)形泰勒蟲(chóng)意大利株(GenBank登錄號(hào)：MT341858)同源性為100%，與環(huán)形泰勒蟲(chóng)喀什株(GenBank登錄號(hào)：MK415058)同源性為99%；本文所檢測(cè)到的綿羊泰勒蟲(chóng)與綿羊泰勒蟲(chóng)蘇丹株(GenBank登錄號(hào)：AY260171)同源性97%。對(duì)隱藏巴貝斯蟲(chóng)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以環(huán)形泰勒蟲(chóng)喀什株(GenBank登錄號(hào)：MK415058)作為外類(lèi)群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本文所測(cè)定的隱藏巴貝斯蟲(chóng)與隱藏巴貝斯蟲(chóng)土耳其株(GenBank登錄號(hào)：KP745626)同源性為100%(圖7、圖8)。

圖7 基于環(huán)形泰勒蟲(chóng)、綿羊泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖8 基于隱藏巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

新疆共發(fā)現(xiàn)2科9屬45種蜱類(lèi)，蜱類(lèi)的組成與中亞地區(qū)蜱類(lèi)的組成較為相似，優(yōu)勢(shì)蜱屬主要有璃眼蜱屬、革蜱屬、扇頭蜱屬等，約占全國(guó)硬蜱總數(shù)的30%以上。本試驗(yàn)對(duì)硬蜱盾板形狀大小及表面刻點(diǎn)大小分布、假頭基形狀、須肢長(zhǎng)短粗細(xì)、緣垛大小形狀、足第1基節(jié)內(nèi)外距長(zhǎng)度、足肢有無(wú)環(huán)帶、氣門(mén)板形狀等特征觀察，在光學(xué)顯微鏡下初步鑒定結(jié)果為2屬5種，按照數(shù)量多少依次為小亞璃眼蜱(293只)、亞洲璃眼蜱(100只)、圖蘭扇頭蜱(79只)、麻點(diǎn)璃眼蜱(47只)、血紅扇頭蜱(5只)。初步統(tǒng)計(jì)小海子墾區(qū)及周邊硬蜱的優(yōu)勢(shì)種主要有小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、圖蘭扇頭蜱。曾記載的銀盾革蜱(Dermacentorniveus)、嗜駝璃眼蜱(H.dromedarii)等蜱種未采集到，可能與采集時(shí)間、氣候改變或植被分布有關(guān)。

為確定采集的5種硬蜱為牛梨形蟲(chóng)病的傳播媒介，對(duì)524只硬蜱進(jìn)行梨形蟲(chóng)18S rRNA特異性目的片段擴(kuò)增，結(jié)果表明,小亞璃眼蜱和圖蘭扇頭蜱為梨形蟲(chóng)病的媒介蜱。在524份樣品中，共檢測(cè)出69份陽(yáng)性樣品，總陽(yáng)性率為13.17%，其中環(huán)形泰勒蟲(chóng)占67份，其余2份是綿羊泰勒蟲(chóng)和隱藏巴貝斯蟲(chóng)。小亞璃眼蜱感染率最高(23.21%)，且攜帶環(huán)形泰勒蟲(chóng)和隱藏巴貝斯蟲(chóng)2種蟲(chóng)種；圖蘭扇頭蜱感染率為1.27%，并發(fā)現(xiàn)了綿羊泰勒蟲(chóng)。環(huán)形泰勒蟲(chóng)作為流行最廣的泰勒蟲(chóng)種之一，已證實(shí)其傳播媒介包括小亞璃眼蜱。小亞璃眼蜱在若蟲(chóng)、成蟲(chóng)階段均能傳播環(huán)形泰勒蟲(chóng)，而亞洲璃眼蜱各階段試驗(yàn)結(jié)果均為陰性[10]。

隱藏巴貝斯蟲(chóng)在我國(guó)少有記載，在中哈邊境阿拉山口出首次檢測(cè)到隱藏巴貝斯蟲(chóng)[11]，且媒介蜱為亞洲璃眼蜱，本病原在非洲由邊緣璃眼蜱(H.marginatum)經(jīng)卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)傳播。本試驗(yàn)在小亞璃眼蜱中檢測(cè)到該巴貝斯蟲(chóng)種，由此推斷隱藏巴貝斯蟲(chóng)的媒介蜱種類(lèi)較多，表明不僅在邊境地區(qū)，疆內(nèi)也出現(xiàn)了該病原，應(yīng)提高外來(lái)牲畜或進(jìn)出口貨物的檢疫。綿羊泰勒蟲(chóng)僅在我國(guó)新疆地區(qū)分布較為廣泛，與墾區(qū)牛、羊混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式有很大關(guān)系。綿羊泰勒蟲(chóng)的傳播媒介尚不清楚，扇頭蜱屬、血蜱屬、革蜱屬中的部分蜱種均能作為其媒介蜱。新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的綿羊泰勒蟲(chóng)其媒介蜱為小亞璃眼蜱，本文發(fā)現(xiàn)的媒介蜱為圖蘭扇頭蜱，因只有1份陽(yáng)性樣品，其可能性有待進(jìn)一步研究。