李 超，王明瓊，趙永攀，董 強(qiáng)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.西藏錯(cuò)那縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏錯(cuò)那 856700； 3.西藏乃東區(qū)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏乃東 856100；4.陜西省畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心，陜西涇陽 713700)

通常將奶牛分娩前后2周～3周的這段時(shí)間稱為圍產(chǎn)期，其特征是奶牛機(jī)體發(fā)生重要的生理、代謝和營養(yǎng)變化。由于妊娠后期/泌乳初期，胎兒發(fā)育和泌乳對鈣的生理需求劇增，加之鈣的攝入不足，奶牛機(jī)體的血鈣動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而導(dǎo)致低鈣血癥的發(fā)生。臨床上將低鈣血癥分為臨床型(Ca≤1.4 mmol/L)和亞臨床型(1.4 mmol/L

本研究通過對陜西地區(qū)某奶牛場90頭圍產(chǎn)期奶牛進(jìn)行連續(xù)血鈣、肝功、體況等指標(biāo)監(jiān)測，對圍產(chǎn)期低鈣血癥奶牛的血液生化指標(biāo)進(jìn)行比較，研究低鈣血癥奶牛和健康奶牛血液生化指標(biāo)的變化，為進(jìn)一步了解規(guī)?；B(yǎng)殖模式中奶牛低鈣血癥的發(fā)病規(guī)律、特點(diǎn)和臨床診斷等提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 根據(jù)預(yù)產(chǎn)期/生產(chǎn)日期，選取陜西省西安市某奶牛場90頭圍產(chǎn)期奶牛,根據(jù)奶牛臨床檢查和血液生化指標(biāo)，將奶牛分為健康奶牛26頭(normocalcemic,NORM; Ca≥2.0 mmol/L)，臨床低鈣血癥奶牛4頭(clinically hypocalcemic,CLIN；連續(xù)1次或1次以上Ca≤1.4 mmol/L，且無分娩癱瘓)和亞臨床低鈣血癥奶牛15頭(subclinically hypocalcemic,SUB；2次取樣，1.4 mmol/L

1.1.2 主要試劑與儀器 谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)測定試劑盒(MDH法),貝克曼庫爾特(中國)有限公司；游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)測定試劑盒(ACS-ACOD酶法)，北京利德曼生化股份有限公司；β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)測定試劑盒(循環(huán)酶法)，上海景源醫(yī)療器械有限公司；葡萄糖(Glucose,Glu)測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法)、鈣(Ca)測定試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合酮法)、磷(P)測定試劑盒(磷鉬酸鹽法)和鎂(Mg)測定試劑盒(二甲苯胺藍(lán)法)，中生北控生物科技股份有限公司；鉀(K)測定試劑盒(四苯硼鈉比濁法)，北京北檢·新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司。AU5800全自動(dòng)生化分析儀，Beckman Couliter公司；乳成分分析儀，上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；臺式離心機(jī)TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠；-80℃超低溫冰箱，中科美菱公司。

1.1.3 血液樣品采集 根據(jù)養(yǎng)殖場記錄的預(yù)產(chǎn)期/生產(chǎn)日期，于產(chǎn)前2周(-2W)、產(chǎn)前1周(-1W)、產(chǎn)后1周(+1W)、產(chǎn)后2周(+2W)分別對試驗(yàn)?zāi)膛＿M(jìn)行連續(xù)跟蹤采樣。血液樣品的采集均于早晨投飼前空腹頸靜脈無菌采血10 mL，37℃水浴30 min，3000 r/min 4℃離心10 min。收集血清分裝于無菌凍存管中，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 血液生化指標(biāo)測定 血清中BHBA、NEFA、AST、Ca、P、Mg、K等生化指標(biāo)在西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,用BECKMAN COULITER AU5800全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測定。具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.1.5 數(shù)據(jù)收集 體況評分(body condition score,BCS)參照文獻(xiàn)[7]于樣品采集時(shí)評估，記錄乳牛的干奶天數(shù)、日采食量、配種次數(shù)、年齡、胎次等信息。

1.1.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用Mean±SE表示。用Bivariate correlations (Pearson檢驗(yàn))對指標(biāo)間的相關(guān)性分析，通過Logistic回歸分析指標(biāo)對低鈣血癥的影響。檢測結(jié)果用GraphPad prism 8對各處理組間數(shù)據(jù)對比作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同階段奶牛低鈣血癥發(fā)病率

90頭奶牛有59頭發(fā)生低鈣血癥，發(fā)病率65.6%，其中臨床低鈣血癥奶牛4頭，發(fā)病率4.4%，亞臨床低鈣血癥奶牛55頭，發(fā)病率61.1%。亞臨床低鈣血癥主要發(fā)生于產(chǎn)前1周和產(chǎn)后2周，其中產(chǎn)后1周亞臨床型發(fā)病率最高，為34.8%(表1)。產(chǎn)前1周至產(chǎn)后2周發(fā)生亞臨床低鈣血癥主要集中在3胎～ 4胎，隨著圍產(chǎn)期時(shí)間的延長，經(jīng)產(chǎn)奶牛亞臨床低鈣血癥發(fā)病率越高(表2)。產(chǎn)后1周奶牛血Ca濃度與胎次呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但健康奶牛和亞臨床低鈣血癥奶牛不顯著(P>0.05)(表3)。

表1 圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥發(fā)病率

2.2 奶牛血清中鈣、磷、鎂、鉀濃度的變化

成年牛血液中Ca、P、Mg、K的參考范圍為2.0 mmol/L～2.5 mmol/L、1.3 mmol/L～2.6 mmol/L、0.75 mmol/L～1.0 mmol/L、3.9 mmol/L～5.8 mmol/L(圖1～圖3)，圍產(chǎn)期奶牛血液中Ca、P、Mg、K濃度呈現(xiàn)波動(dòng)，Mg和K濃度均低于正常范圍；SUB奶牛血液中Ca、P、K濃度從產(chǎn)前2周開始降低，產(chǎn)后1周降至最低，產(chǎn)后2周逐漸恢復(fù)；血液中Mg從產(chǎn)前2周開始升高，產(chǎn)后1周降低，產(chǎn)后2周逐漸恢復(fù)。產(chǎn)前2周內(nèi)，CLIN奶牛血液中Ca濃度顯著低于SUB奶牛和NORM奶牛(P<0.01)，產(chǎn)后1周升高至正常水平；整個(gè)圍產(chǎn)期，血液中K濃度低于SUB奶牛和NORM奶牛，但差異不顯著(P>0.05)；產(chǎn)后1周，SUB奶牛血液中Ca濃度顯著低于NORM奶牛(P<0.01)。

表2 奶牛圍產(chǎn)期胎次與低鈣血癥發(fā)病率

表3 產(chǎn)后1周血Ca與年齡、胎次相關(guān)性分析

2.3 低鈣血癥乳牛血液中礦物質(zhì)含量相關(guān)性分析

圍產(chǎn)期低鈣血癥奶牛產(chǎn)前2周血液中Mg、K濃度與產(chǎn)前1周、產(chǎn)后1周～2周呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。Ca、P差異不顯著(P>0.05)(圖4和表4)。

圖1 血液中血鈣變化曲線

圖2 血液中血磷變化曲線

圖3 血液中血鎂變化曲線

2.4 血糖濃度和體況的變化

成年奶牛血液中Glu正常參考濃度為1.7 mmol/L～4.3 mmol/L，BCS高于3.75較為肥胖，低于2.5表明較瘦(圖5～圖6)，圍產(chǎn)期所有奶牛血液Glu濃度均在正常范圍，NORM和SUB奶牛從產(chǎn)前2周逐漸降低，但波動(dòng)不大，CLIN奶牛從產(chǎn)前2周開始逐漸升高，產(chǎn)后1周達(dá)到最高，隨后逐漸恢復(fù)。NORM和CLIN奶牛在產(chǎn)前較為肥胖；所有奶牛BCS從產(chǎn)前2周開始均逐漸降低，分娩后BCS大幅降低，產(chǎn)后1周達(dá)到最低，此后逐漸恢復(fù)；與NORM奶牛相比，CLIN奶牛產(chǎn)前1周至產(chǎn)后1周，BCS丟失幅度較大(0.63±0.32)。

圖4 血液中血鉀變化曲線

表4 圍產(chǎn)期低鈣血癥奶牛血清鎂、鉀濃度相關(guān)性分析

圖5 血液中血糖變化曲線

2.5 血清中AST、BHBA和NEFA濃度的變化

成年奶牛血液中BHBA、NEFA和AST正常濃度分別為<1.0 mmol/L，0.02 mmol/L～0.78 mmol/L和45 U/L～110 U/L(圖7～圖9)，圍產(chǎn)期奶牛從產(chǎn)前2周開始血清中BHBA、NEFA和AST濃度逐漸上升，產(chǎn)后1周達(dá)到最高，此后逐漸降低。產(chǎn)前2周、產(chǎn)后1周和2周，CLIN奶牛血液中NEFA濃度顯著高于SUB奶牛和NORM奶牛(P<0.01)，產(chǎn)后1周高于正常范圍；產(chǎn)后1周血液中BHBA濃度顯著高于SUB奶牛和NORM奶牛(P<0.05)，但仍處于正常范圍；產(chǎn)后2周血液中AST濃度顯著高于SUB奶牛和NORM奶牛(P<0.05)，高于正常范圍。

圖6 體況變化曲線

圖7 谷草轉(zhuǎn)氨酶變化曲線

圖8 β-羥丁酸變化曲線

圖9 游離脂肪酸變化曲線

3 討論

3.1 分娩泌乳導(dǎo)致礦物元素濃度大幅降低

隨著奶牛泌乳量的增加，機(jī)體的礦物質(zhì)元素大量消耗，易誘發(fā)低鈣血癥和低鎂血癥等發(fā)生。本文結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期臨床低鈣血癥奶牛血清中Ca、P濃度波動(dòng)較大，Mg和K濃度低于正常參考范圍；產(chǎn)前2周開始，血清中P濃度逐漸降低，產(chǎn)后1周最低，隨后逐漸恢復(fù)；血清中Ca濃度先降低后升高，隨后逐漸恢復(fù)。產(chǎn)后1周，圍產(chǎn)期奶牛血清中Ca、P、Mg和K濃度降低可能與產(chǎn)仔和產(chǎn)奶量增加有關(guān)[8]。當(dāng)甲狀旁腺的鈣敏感受體檢測到血液中Ca濃度降低可誘導(dǎo)甲狀旁腺激素的釋放，刺激破骨細(xì)胞生成，引起血液中Ca濃度增加[8-9]。本研究顯示，臨床低鈣血癥奶牛產(chǎn)前2周內(nèi)血清中Ca濃度顯著降低，但產(chǎn)后恢復(fù)正常，這可能與低鈣血癥奶牛產(chǎn)前血清中Ca濃度降低，奶牛機(jī)體動(dòng)員骨Ca釋放有關(guān)。產(chǎn)前2周，低鈣血癥奶牛血清中Mg和K濃度與產(chǎn)后濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這為奶牛低鎂血癥和低鉀血癥產(chǎn)前監(jiān)測預(yù)警產(chǎn)后模型的建立，預(yù)防和治療產(chǎn)后奶牛低鎂血癥和低鉀血癥提供了可能性。

3.2 低鈣血癥促進(jìn)能量負(fù)平衡的發(fā)生

圍產(chǎn)期奶牛血清中AST、NEFA含量從產(chǎn)前2周開始逐漸升高，分娩后升高幅度較大，產(chǎn)后1周達(dá)到最高(臨床低鈣血癥奶牛產(chǎn)后2周達(dá)到最高)，此后逐漸恢復(fù)；低鈣血癥奶牛血液中BHBA濃度從產(chǎn)前1周開始大幅升高，產(chǎn)后1周達(dá)最高水平，隨后逐漸恢復(fù)，亞臨床低鈣血癥和健康奶牛波動(dòng)幅度不大；Glu濃度在圍產(chǎn)期呈現(xiàn)不同程度的波動(dòng)。產(chǎn)后1周，臨床低鈣血癥奶牛血清中BHBA、NEFA濃度顯著高于亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛(P<0.05)，產(chǎn)后2周AST濃度呈現(xiàn)升高趨勢，表明產(chǎn)后2周內(nèi)臨床低鈣血癥奶牛更易產(chǎn)后能量負(fù)平衡，使肝細(xì)胞呈現(xiàn)功能性損傷；產(chǎn)后1周血清中AST、NEFA和BHBA濃度顯著升高，表明隨著分娩和泌乳的啟動(dòng)，奶牛機(jī)體肝臟脂質(zhì)代謝的增強(qiáng)，能量負(fù)平衡較為明顯。產(chǎn)前2周，臨床低鈣血癥奶牛血清中NEFA高于健康奶牛，而Glu卻低于健康奶牛，表明血清中NEFA的變動(dòng)要先于BHBA。Ca在免疫細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞中作為第2信使可誘導(dǎo)亞臨床低鈣血癥奶牛胰島素濃度的降低[10]，加之分娩泌乳啟動(dòng)，奶牛機(jī)體脂肪動(dòng)員增加，更多的體脂轉(zhuǎn)化為NEFA和Glu，導(dǎo)致血液中Glu和NEFA升高。

3.3 生產(chǎn)管理因素影響低鈣血癥的發(fā)生

農(nóng)場管理、日糧營養(yǎng)、休息和活動(dòng)量等均影響圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥的發(fā)生[1,8,11]。高胎次奶牛亞臨床低鈣血癥的發(fā)病率越高，圍產(chǎn)期奶牛的年齡和胎次與產(chǎn)后1周血清中Ca濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明奶牛年齡和胎次越高，產(chǎn)后1周低鈣血癥患病風(fēng)險(xiǎn)越高。本文所用奶牛有初產(chǎn)奶牛，也有2胎 ～ 6胎的經(jīng)產(chǎn)奶牛，健康奶牛和亞臨床低鈣血癥奶牛相比胎次差異不顯著(P>0.05)，繁殖性能是否影響圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥有待研究。分析產(chǎn)后2周奶牛泌乳相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)臨床低鈣血癥奶牛牛奶中乳蛋白率(2.79±0.11)顯著低于健康奶牛(3.23±0.29)(P<0.05)。泌乳前3 d血清中Ca≤2.15 mmol/L,慢性亞臨床低鈣血癥奶牛與健康奶牛相比，懷孕率降低了70%，表明低鈣血癥可降低奶牛生產(chǎn)性能[12]。