劉逸雷，丁康寧，侯曉礁，秦俊杰，李偉豪，謝智江，劉玉清，何永明，唐陸平*

(佛山科學技術(shù)學院動物醫(yī)學系，廣東佛山 528000；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102629)

熱應激是動物應對周圍高溫環(huán)境產(chǎn)生的一種非特異性反應的總和，當溫度過高或持續(xù)時間過長時，機體無法進行適應調(diào)整，則發(fā)生熱應激[1]。長期暴露在炎熱的環(huán)境，體內(nèi)過多的熱量積累會影響機體組織和器官[2]，肺作為機體最重要的散熱和氣體交換器官，在熱應激時動物的快速喘息容易造成肺的損傷，影響肺臟的通氣功能，進而影響腦和胃腸道等重要組織器官[3]。隨著全球氣候變暖和集約化高密度的養(yǎng)殖方式，畜禽更易受到熱應激危害，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[4]。

柴胡口服液(Radix bupleuri oral liquid，RBO)具有解表退熱功能，在臨床上緩解由高熱引起家禽的不良反應具有一定的效用[5]。方中主要成分柴胡經(jīng)提取精致成中藥合劑[6]，其中含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、多糖等有效成分[7]，可治療肺損傷和提高機體免疫功能。本文以肉雞為試驗動物探索柴胡口服液對熱應激肉雞肺損傷的緩解及作用機理，以期為臨床實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 柴胡口服液(清開素)由北京生泰爾科技股份有限公司提供(批準文號：獸藥字010125347)；解暑抗熱散(批號：20190613)，泰安市泰山神藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；白介素6(IL-6)、白介素2(IL-2)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司產(chǎn)品；IL-6、TNF-α、IL-1β、NLPR3、NF-κB抗體，美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 1日齡健康肉雞120只，雌雄各半，購于佛山市南海種雞場。肉雞購回后常規(guī)飼養(yǎng)至21日齡時開始試驗。

1.1.3 主要儀器設備 酶標儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機，德國MICROM產(chǎn)品；高速低溫離心機，德國Eppendorf產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 將21日齡肉雞隨機分為正常對照組、熱應激組、熱應激+陽性藥物組、熱應激+柴胡口服液低劑量、熱應激+柴胡口服液中劑量組和熱應激+柴胡口服液高劑量組，每組20只。正常對照組溫度控制在25℃±2℃，熱應激各組溫度控制為：白天35℃±2℃(10：00～16：00)，其余時間(16：00到翌日10：00)則飼養(yǎng)在25℃±2℃環(huán)境中，相對濕度均保持在60%～70%。各組動物分籠，均自由采食和飲水，其中陽性藥物組每1 kg飼料添加10 g解暑抗熱散；柴胡口服液低劑量組每1 kg飲水添加0.75 mL柴胡口服液；中劑量組每1 kg飲水添加1 mL柴胡口服液；高劑量組每1 kg飲水添加1.25 mL柴胡口服液。分別于熱應激第5天和第10天各剖殺一部分雞用于相關指標檢測。

1.2.2 ELISA檢測肉雞血清中炎性因子水平 分別于熱應激第5天和第10天從每組隨機挑選10只肉雞，進行靜脈采血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測血清中細胞因子IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的水平，按試劑盒說明書進行。

1.2.3 HE染色觀察肺組織病理變化 將肉雞于熱應激第5天、第10天隨機處死后摘取肺組織用中性PBS沖洗，取部分肺臟置于40 mL/L多聚甲醛液中固定48 h。固定完成后取出，用流水沖凈固定液(6 h 以上)，取出肺組織依次用500、700、800、950、1000 mL/L酒精對組織進行梯度脫水。脫水后將組織浸泡于二甲苯∶乙醇(1∶1)混合液中 15 min，取出后放入二甲苯中 15 min 進行透明。將透明好的樣品置于熔融的石蠟Ⅰ中浸蠟1 h，隨后轉(zhuǎn)移至石蠟Ⅱ和石蠟Ⅲ中各浸蠟 1 h，完成浸蠟后取出組織于包埋框中包埋組織，做好標記并切片。HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.2.4 檢測熱應激肉雞肺臟器官指數(shù) 于熱應激第5天、第10天隨機挑選10只雞，處死后摘取肺組織用中性PBS沖洗并用吸水紙擦干后稱重，計算肺臟的器官指數(shù)，肺指數(shù)=肺臟重量(g)/體重(g)。

1.2.5 Western blot法檢測肉雞肺臟組織炎癥相關因子的蛋白表達水平 將熱應激第5天和第10天取得肺組織部分迅速投入液氮中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?00 mg肺組織加入RIPA裂解液并置于冰上裂解30 min，隨后于4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清進行BCA定量，按1∶4體積加入5×SDS蛋白上樣緩沖液和上清液，充分混勻后煮沸變性10 min；取變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，并通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)50 mL/L脫脂牛奶封閉后洗滌室溫下孵育一抗(β-actin、p-p65、p65、NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α)3 h，再次洗滌后孵育相應二抗，用ELC發(fā)光液進行顯影。

1.2.6 統(tǒng)計分析 用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計和處理數(shù)據(jù)，t檢驗法進行差異比較；用Graph Pad Prism 8.0軟件對測得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熱應激肉雞血清中炎性因子水平變化

慢性熱應激第5天，血清中IL-6和TNF-α含量各組無明顯差異，熱應激組的IL-2和IL-1β含量相對空白組顯著上升(P<0.01，P<0.05)，柴胡口服液各劑量組的IL-1β含量相對熱應激組均顯著性降低。熱應激第10天，各組肉雞血清中的IL-2和IL-1β含量無顯著差異，而熱應激組IL-6和TNF-α含量相對空白組極顯著增加(P<0.01，P<0.01)；與熱應激10天組相比，柴胡口服液各劑量均能顯著降低肉雞血清中IL-6和TNF-α水平(圖1)。

與空白組相比,#P<0.05，# #P<0.01；與熱應激組相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01 ; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 熱應激肉雞肺臟組織病理變化

空白組的肺臟肺泡結(jié)構(gòu)明顯，肺間質(zhì)無明顯充血；熱應激第5天，肺泡結(jié)構(gòu)明顯擴張，熱應激第10天，組織間隙顯著出血；陽性藥物組熱應激第5天可見血管少量充血，第10天血管出血更加明顯；柴胡口服液各劑量組的肺泡結(jié)構(gòu)相對正常，充血、出血現(xiàn)象較少(圖2)。

2.3 熱應激肉雞肺組織重量變化

與正常組相比，熱應激第5天與第10天均能顯著增加肉雞肺指數(shù)(P<0.01，P<0.05)，而陽性藥物及柴胡口服液5天組均能顯著降低肉雞肺指數(shù)，陽性藥物及柴胡口服液各劑量10天組對肺指數(shù)無明顯影響，說明柴胡口服液5天組能顯著降低熱應激引起肺水腫，對熱應激肉雞肺臟有一定保護作用(圖3)。

2.4 熱應激肉雞肺臟中IL-6和TNF-α蛋白的表達

與空白組相比，熱應激第5天組肉雞肺臟中IL-6和TNF-α表達量極顯著上升(P<0.01)，而藥物組和柴胡口服液劑量組均能顯著降低肺組織中IL-6和TNF-α的含量。與空白組相比，熱應激第10天組肉雞肺臟中IL-6表達量顯著上升，而TNF-α含量顯著下降；與熱應激10天組相比，陽性藥物組的IL-6含量顯著上升，僅柴胡口服液高劑量組的IL-6和TNF-α的表達呈顯著下調(diào)(圖4)。

A.空白對照組；B.熱應激組；C.陽性藥物組；D.柴胡低劑量組；E.柴胡中劑量組；F.柴胡高劑量組； A.Control group; B.Heat stress group; C.Positive group; D.RBO-low group; E.RBO-mid group; F.RBO-high group圖2 柴胡口服液對熱應激肉雞肺組織病理學變化的影響(HE，40×)

2.5 熱應激肉雞肺臟組織中NLRP3和IL-1β表達

與空白組相比，熱應激5天組肉雞肺組織中NLRP3表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，IL-1β含量在熱應激第5天和第10天時均顯著增加(P<0.01，P<0.01)；與熱應激組相比，陽性藥物組和柴胡口服液各劑量組均能降低第5天和第10天肉雞肺組織中NLRP3和IL-1β的蛋白表達(圖5)。

2.6 熱應激肉雞肺組織中NF-κB p65及磷酸化蛋白含量

與空白組相比，熱應激第5天和第10天組肉雞肺組織中磷酸化p-65蛋白與非磷酸化p-65表達比例顯著增加，與熱應激組相比，陽性藥物組僅在熱應激第5天下調(diào)了磷酸化p-65蛋白的表達，而柴胡口服液各劑量組均能顯著下調(diào)第5天和第10天熱應激肉雞肺臟中磷酸化p-65的蛋白表達(圖6)。

3 討論

慢性熱應激可導致雞肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，與鼠的急性肺損傷的得到的結(jié)果相似[8]，且隨著熱應激時間的延長，出現(xiàn)明顯的出血和充血現(xiàn)象，而經(jīng)柴胡口服液治療后，可減輕熱應激所致的肺損傷，說明柴胡口服液能預防和緩解熱應激。

與空白組相比,#P<0.05，# #P<0.01；與熱應激組相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P< 0.01,vs.heat stress group.

慢性熱應激對機體的影響還體現(xiàn)在引起血清中IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的變化[9]以及提高IL-6和TNF-α等促炎基因mRNA的表達[10]。熱應激第5天時，血清中IL-2和IL-1β的含量增加，而在熱應激第10天時，IL-6和TNF-α的升高，說明在熱應激期間不同的炎性因子在不同時期起作用。IL-6具有誘導B細胞的分化產(chǎn)生免疫球蛋白[11]、激活NK細胞的功能 ，可以被IL-1β和TNF-α誘導表達，同時又能抑制IL-1β和TNF-α的過度表達，在炎癥反應中具有促炎及抗炎作用。IL-2可與IFN-β共同誘導淋巴細胞活化殺傷細胞的殺傷活性，促進T細胞表達IL-2受體，增加機體對病原體的抵抗力，加速對外來病源體的清除。

核因子-κB(NF-κB)是機體中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，一般以兩個蛋白亞基p65(RelA)和p50(NF-κB)組成異源二聚體的形式與IκB結(jié)合存在于細胞質(zhì)中，此時無轉(zhuǎn)錄活性。當機體受到外來刺激或者體內(nèi)的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α刺激時，可活化NF-κB進入細胞核，與核內(nèi)靶基因啟動子特定基因序列結(jié)合，激活炎性級聯(lián)反應，在肺臟炎癥反應中起關鍵作用。炎癥小體(NLRP3)的激活需要先經(jīng)過Toll樣受體識別危險相關的分子模式或病原體相關的分子模式激活NF-κB的和誘導Pro-IL-1β的生成才能進行啟動，隨后在各種細胞外刺激下觸發(fā)炎癥復合體的組裝才能最終激活產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β[12]。本文證明熱應激前期可明顯促進肉雞肺臟NF-κB p65蛋白及其磷酸化蛋白的表達，促進炎性相關因子NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α的積累，表明慢性熱應激可能激活了NF-κB信號通路，促進下游IL-6和TNF-α的表達，同時還激活了NLRP3，促進IL-1β的表達，柴胡口服液可通過抑制上述過程減輕熱應激造成的炎性損傷。

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

慢性熱應激可誘導肉雞肺部炎性損傷，而柴胡口服液可能通過抑制NF-κB-NLRP3信號通路減少炎性因子表達從而緩解熱應激引起的炎性損傷，表明柴胡口服液具有明顯的抗熱應激效果，可用于臨床上家禽慢性熱應激的預防和治療。