彭凡洋，賽務(wù)加甫，冷青文

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

芽孢桿菌作為新型動(dòng)物微生態(tài)飼料添加劑，具有無(wú)毒副作用、代謝快和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。芽孢桿菌在微生態(tài)制劑中以內(nèi)生孢子形式存在，進(jìn)入動(dòng)物腸道后，孢子在腸道能迅速定繁并分泌活性強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，有助于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，產(chǎn)生細(xì)菌素拮抗腸道致病菌，通過(guò)生物奪氧消耗腸道內(nèi)的氧氣造成厭氧環(huán)境，有利于維持腸道的生態(tài)平衡[3-4]。本試驗(yàn)主要研究芽孢桿菌對(duì)新疆哈薩克羔羊腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響，為芽孢桿菌在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株來(lái)源 3月齡健康、體質(zhì)量相近的新疆哈薩克羔羊28只，雌雄不限，購(gòu)于伊犁哈薩克種羊場(chǎng)。芽孢桿菌HS06菌株為石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室留存菌種。

1.1.2 主要試劑 免疫組化(IHC)試劑盒套裝(抗兔)、IL-6兔單克隆抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、試劑均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；石蠟包埋與切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品；攤片機(jī)(KD-T)，浙江科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 采用單因子設(shè)計(jì)，將24只3月齡的健康新疆哈薩克羔羊，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧并灌服生理鹽水；試驗(yàn)組(BL)羔羊灌服 不少于108CFU以上芽孢桿菌HS06溶液[5]。試驗(yàn)共21 d，其中適應(yīng)期6 d，預(yù)飼期7 d，正式試驗(yàn)期14 d，日喂2次菌液，自由采食飲水。

1.2.2 菌懸液制備 芽孢桿菌HS06接種至LB營(yíng)養(yǎng)肉湯內(nèi)，37℃培養(yǎng)1 d后，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)顯示芽孢桿菌HS06菌液約為13×108CFU/mL。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)第20天，用抹脖法放血屠宰羔羊，迅速剖開(kāi)腹腔，分別切取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸2 cm～3 cm組織塊，用9 g/L生理鹽水漂洗，組織塊置于40 mL/L多聚甲醛液(0.1 mol/L，pH7.2)中固定24 h。

1.2.4 HE染色 常規(guī)石蠟包埋，制備連續(xù)切片，厚度5 μm。將腸道切片置于新鮮二甲苯中脫蠟2次，每次5 min。脫蠟后，依次放入無(wú)水乙醇2 min、950 mL/L乙醇2 min、850 mL/L乙醇2 min、700 mL/L乙醇2 min。蒸餾水洗2～3次。蘇木精染核2 min～3 min，蒸餾水中略洗，再進(jìn)入鹽酸酒精分化20 s。在流水中放置10 min～15 min。伊紅溶液染胞質(zhì)10 s。將切片依次放入950 mL/L乙醇2 min、950 mL/L乙醇2 min、無(wú)水乙醇2 min、無(wú)水乙醇2 min。二甲苯透明5 min，重復(fù)2次。用中性樹(shù)膠封片。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 免疫組化染色按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，石蠟切片脫蠟水化，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中用微波爐熱修復(fù)，冷卻至室溫后取出。在室溫下用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育30 min。切片用山羊血清37℃封閉20 min。擦干切片上多余液體，滴加一抗( 1∶500 )后切片于濕盒37℃孵育1 h～2 h,用PBS緩沖液做一抗的陰性對(duì)照組；0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗5 min×3次。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃，20 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗5 min×3次；滴加SABC試劑37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗5 min×3次；DAB顯色：顯微鏡下控制時(shí)間，暗處反應(yīng)3 min～5 min，水洗；并用蘇木精復(fù)染1 min～5 min，自來(lái)水沖洗后。置于溶液中脫水透明后用中性樹(shù)脂封片。在光鏡下，藍(lán)色為細(xì)胞核，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) 將腸道切片在光鏡下觀察拍照，分別比較各組羔羊腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行腸道形態(tài)學(xué)觀察。檢測(cè)每組羔羊不同腸段的絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度以及肌層厚度，每張切片選取5個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)選取至少5個(gè)計(jì)數(shù)，取平均值[6],并測(cè)量IL-6陽(yáng)性反應(yīng)的光密度值，取平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼喂芽孢桿菌對(duì)羔羊體重的影響

通過(guò)兩組羔羊分別灌服芽孢桿菌和生理鹽水14 d后發(fā)現(xiàn)，灌服芽孢桿菌的羔羊體重增長(zhǎng)速度明顯高于對(duì)照組(P<0.01，差異極顯著)，特別是灌服7 d后，羔羊呈現(xiàn)代償性生長(zhǎng)，增長(zhǎng)迅速，說(shuō)明芽孢桿菌對(duì)健康羔羊體重的發(fā)育影響較大(圖 1)。

圖1 羔羊體重變化

2.2 飼喂芽孢桿菌對(duì)羔羊小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表1可知，相較對(duì)照組，試驗(yàn)組羔羊十二指腸、空腸和回腸絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度以及肌層厚度皆極顯著增加(P<0.01)(圖2～圖4)。

表1 芽孢桿菌對(duì)羔羊小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 芽孢桿菌對(duì)羔羊大腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表2可知，相較對(duì)照組，試驗(yàn)組羔羊盲腸、結(jié)腸和直腸絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度以及肌層厚度皆顯著增加(P<0.05)(圖5～圖7)。

2.4 飼喂芽孢桿菌對(duì)腸道組織IL-6表達(dá)的影響

各組羔羊腸道組織中IL-6的分布情況見(jiàn)圖8～圖14。在對(duì)照組，羔羊小腸內(nèi)IL-6強(qiáng)表達(dá)于黏膜固有層，弱表達(dá)于黏膜上皮層、黏膜下層和肌層，漿膜不表達(dá)；羔羊大腸內(nèi)IL-6強(qiáng)表達(dá)于黏膜固有層，弱表達(dá)于黏膜上皮層，黏膜下層以及肌層顯示陽(yáng)性反應(yīng)，漿膜不表達(dá)。試驗(yàn)組IL-6強(qiáng)表達(dá)于羔羊小腸的黏膜上皮層和黏膜固有層，弱表達(dá)于肌層，黏膜下層顯示陽(yáng)性反應(yīng)，漿膜無(wú)表達(dá)；羔羊大腸內(nèi)IL-6強(qiáng)表達(dá)于黏膜上皮層和黏膜固有層，黏膜下層以及肌層顯示陽(yáng)性反應(yīng)，漿膜不表達(dá)。

2.5 腸道各段黏膜固有層中免疫反應(yīng)IL-6光密度值分析

由表3可知，IL-6在羔羊小腸黏膜固有層中的光密度值高于大腸中IL-6的光密度值。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組IL-6在羔羊十二指腸、空腸和結(jié)腸黏膜固有層的光密度值皆顯著增高(P<0.05)；其余腸道有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。因此可推測(cè)，IL-6在羔羊腸道中主要活動(dòng)區(qū)域分布于羔羊小腸中，在結(jié)腸有部分分布，盲腸和直腸較少分布；給羔羊喂食芽孢桿菌后，能夠提高羔羊腸道中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)，增加羔羊IL-6的分泌。

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

圖2 芽孢桿菌對(duì)十二指腸微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響(50×)

Fig.2 Effects ofBacillusfeeding on microstructure of duodenum(50×)

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

圖5 芽孢桿菌對(duì)盲腸微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響(50×)

Fig.5 Effects ofBacillusfeeding on microstructure of caecum(50×)

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

3 討論

芽孢桿菌為口服給藥的活微生物，可通過(guò)改善宿主動(dòng)物的腸道平衡產(chǎn)生有益影響[6-7]。芽胞桿菌具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，在反芻動(dòng)物中，芽孢桿菌的孢子與瘤胃中的微生物群相互作用，提高腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。腸道的絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度及肌層厚度是衡量腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)[8]，當(dāng)絨毛長(zhǎng)度增加時(shí)，會(huì)增強(qiáng)腸的消化吸收功能；腸道黏膜越厚，腸道發(fā)育越完善，消化能力越強(qiáng)[9]；黏膜和肌層的增厚，會(huì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂芽孢桿菌對(duì)羔羊發(fā)育有著明顯的促進(jìn)作用，飼喂芽孢桿菌后，羔羊腸道不同腸段絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度及肌層厚度的顯著增厚；小腸的增長(zhǎng)顯著高于大腸，并加快了羔羊的生長(zhǎng)速度。由此可知，芽孢桿菌能夠改善羔羊腸道的結(jié)構(gòu)形態(tài)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能，促進(jìn)羔羊的生長(zhǎng)。

表2 羔羊大腸形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

→黏膜上皮層；▲黏膜固有層；●黏膜下層；◆肌層；bar=100 μm

IL-6也叫B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是機(jī)體為保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而分泌的一種多功能細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化和免疫球蛋白分泌，促進(jìn)殺傷性T細(xì)胞分化并提高其功能[11]。IL-6在機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和免疫防御反應(yīng)中起到重要的作用，是分析機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組IL-6強(qiáng)表達(dá)于羔羊腸道的黏膜上皮層和黏膜固有層，黏膜下層以及肌層顯示陽(yáng)性反應(yīng)，漿膜不表達(dá)。說(shuō)明IL-6在羔羊腸道各段皆有分布，腸道黏膜上皮層和黏膜固有層可視為IL-6參與腸道免疫的主要部位。IL-6在羔羊小腸黏膜固有層中的光密度值高于大腸中IL-6的光密度值，說(shuō)明腸道的免疫反應(yīng)集中在小腸，芽孢桿菌能夠大量定殖于小腸，小腸能夠識(shí)別芽孢桿菌并進(jìn)行相互作用，提高小腸內(nèi)IL-6的分布；大腸中IL-6的陽(yáng)性反應(yīng)略少，可能與大腸的功能有關(guān)，芽孢桿菌只能少量定殖于大腸。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組IL-6在羔羊小腸中十二指腸和空腸黏膜固有層的光密度值皆顯著增高(P<0.05)，說(shuō)明十二指腸和空腸可視為小腸免疫反應(yīng)的主要區(qū)域，能夠快速有效地與芽孢桿菌產(chǎn)生反應(yīng)，提高IL-6的分泌，增強(qiáng)小腸的免疫能力。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組IL-6在羔羊結(jié)腸黏膜固有層的光密度值顯著增高(P<0.05)，說(shuō)明結(jié)腸是大腸免疫反應(yīng)的主要部位，能夠略為靈敏地識(shí)別芽孢桿菌，提升IL-6的分泌，增強(qiáng)大腸的免疫能力。

表3 羔羊腸道黏膜固有層IL-6檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)表明，芽孢桿菌有助于提高羔羊腸道不同腸段絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度及肌層厚度，并顯著提升羔羊體內(nèi)炎癥因子IL-6的水平。由此可推測(cè)，芽孢桿菌能夠促進(jìn)羔羊早期的腸道發(fā)育，大幅促進(jìn)炎癥因子IL-6的生成，有效提升機(jī)體的免疫活性。