郭振環(huán)，李向輝，張志強(qiáng)，胡光遠(yuǎn)，趙 麗，馬 霞,3*，劉永錄

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省中獸藥經(jīng)典名方傳承與創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046； 3.鄭州市中獸藥免疫藥理學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450046)

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一種豬繁殖障礙性疾病[1]，不同年齡、性別的豬均易感，病毒可通過胎盤垂直傳播，帶毒仔豬帶毒排毒時間很長甚至終身。感染種公豬通過配種傳染給易感母豬。懷孕母豬易發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎等，臨床上給母豬接種PPV疫苗預(yù)防該病毒的感染，但預(yù)防效果不理想。從中藥中尋找藥理作用明確的抗病毒成分防控PPV具有重要意義。羌活為傘形科植物羌活的根莖及根，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛及抗血栓形成等作用。主要化學(xué)成分為羌活醇、異歐前胡素、異歐前胡內(nèi)酯、紫花前胡苷元、綠原酸、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯及揮發(fā)油等成分，其中阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是主要有效成分之一，具有清除自由基、抗血栓、抗炎等作用，其衍生物多為脂類、酮類、鹽類等，研究發(fā)現(xiàn)蜂膠中阿魏酸具有抗豬細(xì)小病毒的作用。本試驗檢測羌活中分離的有效活性成分阿魏酸對豬細(xì)小病毒增殖及其介導(dǎo)炎癥因子的影響，探究阿魏酸的抗炎效應(yīng)，為抗病毒藥物的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 PK-15細(xì)胞系由本實驗室凍存保存，PPV病毒滴度1.0×10-6TCID50/mL，由山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院沈志強(qiáng)課題組贈送。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基,2.5 g/L胰酶-EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗、RI-PA裂解液，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。MTT試劑盒、熒光定量SYBR Premix ExTaq試劑盒，諾唯贊生物工程(南京)有限公司產(chǎn)品；羌活有效活性成分阿魏酸由鄭州市中獸藥有效成分免疫藥理學(xué)重點實驗室制備提供(純度>95%)。

1.1.3 主要儀器 CKX53倒置顯微鏡，奧林巴斯株式會社產(chǎn)品；FormaTMSteri-CultTM二氧化碳培養(yǎng)箱，Varioskan LUX 多功能酶聯(lián)免疫檢測儀，Life Technologies 7500Fast熒光定量PCR儀，賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸對PK-15細(xì)胞安全濃度的測定 取對數(shù)期PK-15細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液濃度約為1.0×106個/mL，加入96孔板培養(yǎng)24 h，吸去上清培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(PBS)洗2遍，加入全培養(yǎng)基2倍稀釋阿魏酸有效活性成分為0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 000 μmol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μLCCK-8溶液和90 μL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定各孔OD450nm值，試驗設(shè)空白組與陰性對照組。

細(xì)胞存活率(%)=(試驗組OD450nm值-空白組OD450nm值)/(陰性對照OD450nm值-空白組OD450nm值)

1.2.2 阿魏酸最佳給藥方式 根據(jù)1.2.1篩選的阿魏酸安全濃度，將阿魏酸用全培養(yǎng)基分別配制成10、20、30、40、50 μmol/mL，方式1：藥液與PPV(MOI=1)混勻后，37℃培養(yǎng)箱中4 h，再接種到已長成單層細(xì)胞的96孔板。方式2：向長滿PK-15細(xì)胞的96孔板中每孔加入PPV(MOI=1)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后加入藥液；方式3：向長滿PK-15細(xì)胞的96孔板中每孔加入藥液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，加入PPV(MOI=1)。均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取上清液提取病毒DNA，RT-qPCR方法檢測病毒增殖情況，PCR反應(yīng)體系SYBR Premix ExTiqⅡ(2X)10 μL,DNA 模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s～34 s，35個循環(huán)。

1.2.3 阿魏酸對PPV病毒增殖的抑制試驗 根據(jù)篩選的最佳給藥方式，將長滿PK-15細(xì)胞的96孔板感染PPV(MOI=1)培養(yǎng)4 h后給予羌活有效活性成分阿魏酸30 μmol/mL，分別在0、6、12、24、36、48 h收集病毒上清液，提取病毒DNA，用RT-qPCR方法檢測病毒增殖在PK-15細(xì)胞中的增殖情況。

1.2.4 阿魏酸對PPV病毒感染PK-15細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平影響 將長滿PK-15細(xì)胞的6孔板感染PPV(MOI=1)培養(yǎng)4 h后給予羌活有效活性成分阿魏酸10、20、30 μmol/mL。培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，收集細(xì)胞，用常規(guī)trizol法提取樣品總RNA，用微量核酸蛋白定量儀NanoDropTMOne/OneC檢測總RNA濃度和純度。以1 μg的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系及條件參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒提供的方法進(jìn)行。檢測IL-1β、IL-2、 IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、TGF-β1、PGK1(表1)的動態(tài)表達(dá)，結(jié)束反應(yīng)運用2-△△Ct法分析基因的mRNA表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對PK-15細(xì)胞的安全濃度

用0～1 000 μmol/mL的羌活有效活性成分阿魏酸分別處理PK-15細(xì)胞(圖1)，在濃度低于160 μmol/mL時對PK-15細(xì)胞無毒性作用(P>0.05)，當(dāng)濃度大于160 μmol/mL,細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05，P<0.01)。阿魏酸對PK-15細(xì)胞的安全濃度為0～160 μmol/mL。

*P<0.05，**P<0.01

2.2 不同給藥方式對PPV病毒的抑制效果

給藥方式1和3對PPV無明顯抑制作用(P>0.05)。給藥方式2可有效抑制PPV復(fù)制，且呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)阿魏酸給藥濃度為30 μmol/mL，病毒抑制率出現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，達(dá)到40%以上。說明阿魏酸對PPV有一定的抑制作用，主要作用于病毒感染后期(圖2)。

2.3 阿魏酸對PPV病毒抑制效果

PPV隨時間的增長表達(dá)量升高(圖3A)，但阿魏酸濃度為30 μmol/mL能有效抑制(圖3B)。與PPV(MOI=1)相比，給藥組在24 h和36 h顯著抑制PPV的復(fù)制(P<0.05，P<0.01，圖3C)。

圖2 3種不同給藥方式對PPV病毒抑制效果

圖3 阿魏酸對PPV病毒抑制效果

2.4 阿魏酸對IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17和IL-18mRNA表達(dá)的影響

PPV感染PK-15細(xì)胞顯著升高IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18和降低IL-17的表達(dá)(P<0.01)。在阿魏酸處理PPV感染組中，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001),IL-17顯著升高(P<0.05，P<0.01)(圖4)。

2.5 阿魏酸對TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1mRNA表達(dá)的影響

PPV感染PK-15細(xì)胞顯著升高TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1表達(dá)(P<0.01)。阿魏酸處理PPV感染組中，TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

3 討論

豬細(xì)小病毒主要引起母豬繁殖障礙性疾病[2-3]，還與豬化膿性心肌炎、豬消瘦綜合征及斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征有關(guān)[4-5]，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。蜂膠提取物具有良好的抗豬細(xì)小病毒活性[7-8]，阿魏酸是蜂膠抗豬細(xì)小病毒主要活性成分[9]。

細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞生長以及修復(fù)組織損傷等多種功能。病原體侵入機(jī)體后，能夠觸發(fā)炎癥反應(yīng)，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子來抵抗病原體，從而減輕感染病原體引起的機(jī)體損傷，其中機(jī)體產(chǎn)生大量的致炎性細(xì)胞因子，如IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-8、TNF-α 及 IFN-γ等可消除病原微生物，且致炎性細(xì)胞因子能進(jìn)一步激活中性白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，并產(chǎn)生氧自由基、氮氧化物、蛋白酶、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等；同時機(jī)體也產(chǎn)生大量的內(nèi)源性抗炎細(xì)胞因子，如IL-4及 TGF-β 等參與炎癥反應(yīng)，可見致炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)病毒感染誘導(dǎo)的免疫平衡方面起到至關(guān)重要的作用。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)羌活有效活性成分阿魏酸能夠顯著降低PPV感染PK-15誘發(fā)IL-1β、IL-2、IL-8、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α的表達(dá)，而顯著升高PPV感染PK-15誘發(fā)IL-17的表達(dá)，且與阿魏酸的給藥劑量呈正相關(guān)。表明阿魏酸顯著降低PPV感染細(xì)胞激活細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)水平，推測羌活有效活性成分阿魏酸具有良好的抗炎活性，可減輕炎癥反應(yīng)對機(jī)體的損傷從而具有抗豬細(xì)小病毒的作用。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.01圖4 阿魏酸對IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18、IL-17 mRNA表達(dá)的影響

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.01圖5 阿魏酸對TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1 mRNA表達(dá)的影響