邢 柳，王 利，魏 勇，丁俊仁，袁定勝

(1.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué) 國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；4.四川省畜牧總站，四川成都 610100)

植生拉烏爾菌(Raoultellaplanticola)屬于腸桿菌科、拉烏爾菌屬。植生拉烏爾菌是一種需氧、無(wú)動(dòng)力的革蘭氏陰性腸桿菌。該菌多存在于水、土壤和植物等自然環(huán)境中[1]，也可存在于動(dòng)物黏膜和人體內(nèi)，在免疫力低下的人群中也可發(fā)生感染[2]。拉烏爾菌屬與克雷伯菌屬親緣性較為密切，其先歸為克雷伯菌屬成員[3]。拉烏爾菌是一種條件致病菌，其致病特點(diǎn)和感染引起疾病的臨床癥狀與克雷伯菌類似，并與克雷伯菌屬生化反應(yīng)極其相似[4]。該菌可引起人類的嚴(yán)重感染甚至休克，還可導(dǎo)致膽囊炎、肺炎、菌血癥、泌尿道感染等疾病[5]。植生拉烏爾菌某些菌株有較強(qiáng)毒力，抗菌藥物治療效果不佳[6]。從新生兒呼吸道、人泌尿道、外科手術(shù)感染和敗血癥感染中均有報(bào)道，鴨糞便樣本中也分離到該菌[7]。本研究從四川地區(qū)某規(guī)模化豬場(chǎng)采集的樣品中分離到1株豬源植生拉烏爾菌，將分離菌株進(jìn)行鑒定和致病性試驗(yàn)，為該病的臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樣品來(lái)源于四川省成都市某豬場(chǎng)內(nèi)患病豬的組織病料，無(wú)菌采取病死豬的肝臟、心臟和肺臟等臟器。SPF級(jí)小鼠20只，購(gòu)自四川省成都市中醫(yī)藥研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 LB和Mueller-Hinton Agar培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；PCR聚合酶細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生物有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色試劑盒，北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無(wú)菌操作臺(tái)從患病豬樣品中取樣,劃線接種于LB培養(yǎng)基,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,在培養(yǎng)基上挑取單一的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察,記錄純化菌落的形態(tài)特征,并將獲得的菌株命名為XL-01。

1.2.2 生化鑒定 參照生化管使用說(shuō)明書，將已純培養(yǎng)的菌液，用接種環(huán)分別穿刺接種于細(xì)菌生化鑒定管中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和杭州微生物試劑有限公司提供的《非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.2.3 16S rRNA擴(kuò)增及進(jìn)化樹(shù)分析 將純化細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),置37℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)16 h,離心菌液收集沉淀,根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)菌總DNA。用16S rRNA通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)對(duì)其擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)為陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序完成后，將得到的序列在NCBI的Blast系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)，提交至GenBank獲取登錄號(hào)。在ClustalX2.1軟件中進(jìn)行同源性比對(duì)，并使用MEGA5.0軟件中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[8]。

1.2.4 毒力基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]設(shè)計(jì)毒力基因，設(shè)計(jì)ompX、cpa、hly、sip、fimH、papC和papA共7種毒力基因，用提取的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件依據(jù)參考文獻(xiàn)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 將20只小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。試驗(yàn)前小鼠禁食、禁水24 h，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射活菌液0.15 mL，調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL；對(duì)照組每只小鼠腹腔注射無(wú)菌生理鹽水，劑量和方法同試驗(yàn)組。兩組分開(kāi)正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d并對(duì)各組小鼠的發(fā)病和死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 病理組織切片制作 剖檢死亡小鼠，取腸道、肺臟、肝臟和脾臟等組織，浸泡在40 mg/mL多聚甲醛溶液中，脫水、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察[11-12]。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的紙片擴(kuò)散法(KB)測(cè)定,用藥敏試劑盒的抗菌藥物對(duì)細(xì)菌作藥敏性和耐藥表型測(cè)定。

1.2.8 耐藥基因檢測(cè) 按文獻(xiàn)[13-14]設(shè)計(jì)磺胺類抗菌藥物耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3，氨基糖苷類抗生素基因ant(3″) -Ⅰa、aac(6′) -Ⅰb和aph(3′) -Ⅱa，β-內(nèi)酰胺類抗生素基因TEM的引物對(duì)其DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件依據(jù)參考文獻(xiàn)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及生化鑒定結(jié)果

菌株XL-01在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，形成較小的單一菌落，革蘭氏染色后為紅色(圖1)，呈現(xiàn)單個(gè)或成對(duì)排列，形態(tài)為短桿狀，表明XL-01菌株為革蘭氏陰性菌。生化結(jié)果顯示，分離菌株XL-01對(duì)蜜二糖、鳥氨酸、鼠李糖、賴氨酸和山梨醇反應(yīng)為陽(yáng)性，對(duì)苦杏仁苷、精氨酸雙水解酶、枸櫞酸鈉、蔗糖和氧化酶反應(yīng)為陰性。菌株XL-01與腸桿菌具有相似的表型特征，符合革蘭氏陰性菌的特征。

圖1 XL-01菌株革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)

2.2 16S rRNA基因序列分析

分離XL-01菌株的16SrRNA基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，將得到獲得的16SrRNA基因正反測(cè)序拼接結(jié)果，獲得1 458 bp的片段，提交NCBI后獲得GenBank登錄號(hào)為MW433720。用得到的菌株XL-01序列在NCBI中采用Blast進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，菌株XL-01(圖中“●”標(biāo)記)的16S rRNA序列與植生拉烏爾菌聚為一個(gè)分支，相似性高達(dá)100%。菌株XL-01與植生拉烏爾菌(GenBank登錄號(hào)：NR112011.1)同源性達(dá)95.9%。綜合判斷菌株XL-01為植生拉烏爾菌。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

PCR擴(kuò)增檢出ompX和fimH兩種毒力基因，cpa、hly、sip、papC和papA的基因并未檢出。表明植生拉烏爾菌菌株攜帶這2種毒力基因(圖4)。

2.4 臨床癥狀及死亡情況

第1天試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，飲食下降，眼角有分泌物，眼睛迷離、弓腰，對(duì)照組小鼠健康存活。試驗(yàn)組小鼠第2天開(kāi)始陸續(xù)死亡，共死亡7只，發(fā)病率為100%，病死率為70%。表明該菌株致病性較強(qiáng)。剖檢死亡小鼠,采集病樣再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果判定為植生拉烏爾菌感染。

2.5 病理組織學(xué)結(jié)果

剖檢試驗(yàn)組死亡小鼠，可見(jiàn)小鼠腹腔皮下出血，腦水腫，腸道內(nèi)容物呈現(xiàn)淡黃色液體，肝臟腫大。病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)心臟和脾臟無(wú)明顯病變，肺臟間質(zhì)充血、肺泡壁增厚、斷裂(圖5A)；肝細(xì)胞腫脹、變性，肝竇隙擴(kuò)張充血(圖5B)；腸道絨毛脫落、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血(圖5C)；腎臟中腎小管管腔狹窄，上皮細(xì)胞腫脹變性、有脫落現(xiàn)象(圖5D和圖5E)；腦部可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)(圖5F)。從臨床癥狀與病理變化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XL-01菌株為致病菌，且對(duì)動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株XL-01進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測(cè)，菌株XL-01對(duì)諾氟沙星、阿米卡星、磷霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和拉氧頭孢敏感，菌株XL-01對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢克肟、青霉素、鏈霉素和甲氧芐氨嘧啶耐藥。

2.7 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)植生拉烏爾菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6，擴(kuò)增出耐藥基因TEM、Sul1、Sul2、Sul3、aac(6′)-Ⅰb和ant(3″)-Ⅰa與預(yù)期相符，耐藥基因aph(3′)-Ⅱa未檢出。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.菌株 XL-01；2.陰性對(duì)照 M.DNA Marker DL 2 000;1.Strain XL-01；2.Negative control

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.ompX1；2.fimH M.DNA Marker DL 2 000;1.ompX；2.fimH

3 討論

植生拉烏爾菌作為一種罕見(jiàn)的機(jī)會(huì)性病原體，常侵襲免疫功能低下的患者，有時(shí)甚至引起致命感染[15]。與克雷伯菌屬相似，可感染人的各種器官，如胰腺、皮膚、肝臟、前列腺、結(jié)膜和膽囊[16]。由于植物拉烏爾菌與嚴(yán)重的胃腸道感染有關(guān)，腸移位是一種可能的感染方式[17]。已有報(bào)道醫(yī)院環(huán)境中的非細(xì)菌液體洗手液被植生拉烏爾菌污染[18],其臨床特征和結(jié)果仍有待調(diào)查。本試驗(yàn)腹腔攻毒死亡小鼠均出現(xiàn)腹腔皮下出血、腦水腫、腸道內(nèi)容物呈淡黃色液體和肝臟腫大等病變，表明該植生拉烏爾菌具有較強(qiáng)的致病性。本試驗(yàn)病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)，肝臟中肝細(xì)胞腫脹、變性，肝竇隙擴(kuò)張充血，肺臟中肺間質(zhì)充血、肺泡壁增厚、斷裂，與相關(guān)報(bào)道類似[1，3]，但考慮到菌株的致病性強(qiáng)弱可能與分離地點(diǎn)和分離宿主等不同而異。

從腹腔壁壞死性筋膜炎患者分離的植生拉烏爾菌對(duì)氨芐西林和阿莫西林耐藥[19]，從中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的肺炎和菌血癥患者中分離的植生拉烏爾菌對(duì)氟喹諾酮類和氨基糖苷類敏感[20]，從重癥膀胱炎患者分離得到的植生拉烏爾菌對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、氨基糖苷類、碳青霉素類和磺胺類抗生物敏感[21]。2017年報(bào)道有2例心外科術(shù)后病人感染植生拉烏爾菌而休克[22]。本研究中植生拉烏爾菌對(duì)13種抗菌藥物有不同程度的耐藥。對(duì)7種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，該菌的氨基糖苷類和磺胺類耐藥表型與耐藥基因型結(jié)果大體一致，而與β-內(nèi)酰胺類不一致。這可能是檢測(cè)到的耐藥基因未能表達(dá)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的蛋白質(zhì)分子，也可能存在其他耐藥機(jī)制或該菌對(duì)試驗(yàn)未測(cè)試β-內(nèi)酰胺類有耐藥表型。

A.肺臟,肺間質(zhì)充血、肺泡壁增厚、斷裂；B.肝臟,肝細(xì)胞腫脹、變性，肝竇擴(kuò)張充血；C.腸,腸絨毛脫落、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；D～E.腎臟,腎小管管腔狹窄，上皮細(xì)胞腫脹變性、有脫落現(xiàn)象；F.腦,可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.TEMS；2.ul1；3.Sul2；4.Sul3；5.aph(3′)-Ⅱa；6.aac(6′)-Ⅰb；7.ant(3″)-Ⅰa；8.陰性對(duì)照

本研究從豬肺臟中分離出1株有較強(qiáng)的致病性植生拉烏爾菌，對(duì)常見(jiàn)的抗菌藥物具有較強(qiáng)耐藥性，為今后開(kāi)展植生拉烏爾菌的致病機(jī)制和耐藥性研究提供參考。