歐陽(yáng)艷，周艷榮，方六榮*，肖少波

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以仔豬的呼吸道癥狀和妊娠母豬的繁殖障礙為主要特征的一種烈性傳染病[1-4]。該病最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV后，該病就在我國(guó)廣泛流行并給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了很大損失[5-7]。高度的遺傳變異是PRRSV的一個(gè)重要特征，其中ORF5(GP5)和Nsp2因高變異性常被用于系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析[4-6]。為了更好地監(jiān)測(cè)PRRSV在中國(guó)的流行狀況及遺傳變異，本研究對(duì)采自中國(guó)主要生豬養(yǎng)殖區(qū)疑似PRRSV感染的309份豬肺臟組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)ORF5基因進(jìn)行測(cè)序分析，掌握PRRSV的流行情況和遺傳變異規(guī)律，以期為PRRS的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2017年-2018年，采集中國(guó)主要生豬養(yǎng)殖區(qū)河南、湖北等16省份疑似發(fā)病豬肺臟組織樣品共309份。

1.1.2 主要試劑 RNA PCRTM(AMV)試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、Premix ExTaqTM試劑和pGEM-T-Easy克隆載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker，武漢擎科生物工程有限公司產(chǎn)品；Trizol總RNA提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 組織破碎儀(Thermo)和渦旋振蕩儀，Thermo公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機(jī)，Eppendorf centrifuge公司產(chǎn)品；電泳儀及電泳槽和PCR儀S1000，Bio-Rad公司產(chǎn)品，制冰機(jī)，SANYO公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 無(wú)菌操作取病料，加滅菌PBS充分研磨，制成組織懸液，取上清液用于RNA提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照PRRSV VR-2332全長(zhǎng)基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)專用引物擴(kuò)增Nsp2基因序列的高度可變區(qū)(Classical PRRSVs擴(kuò)增1 072 bp,HP-PRRSVs擴(kuò)增985 bp,NADC30-like PRRSVs擴(kuò)增682 bp)和1對(duì)通用引物檢測(cè)并擴(kuò)增完整的ORF5基因序列(表1)。

1.2.3 RNA提取與PRRSV RT-PCR檢測(cè) 按照病毒核酸步驟提取病毒總RNA，再用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR easyTaqmix 10.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA樣品1 μL，無(wú)RNA 酶水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束，取8 μL PCR產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后在凝膠系統(tǒng)成像儀下觀察結(jié)果。

表1 本研究使用的引物

1.2.4 PRRSV ORF5基因的擴(kuò)增與測(cè)序 使用ORF5引物擴(kuò)增ORF5基因的全長(zhǎng)序列，PCR產(chǎn)物純化后克隆于pGEM-Teasy載體，再轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，驗(yàn)證成功后提取質(zhì)粒，再將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送武漢擎科生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 PRRSV ORF5基因遺傳進(jìn)化分析 用MAFFT軟件對(duì)測(cè)序獲得的53個(gè)ORF5基因序列與GenBank已公布的常用參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析，用Mega-X軟件根據(jù)Neighbor-Joining運(yùn)算法繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化分析所用參考毒株的背景信息見(jiàn)表2。

表2 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品PRRSV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

PRRSV陽(yáng)性率38.51%，其中HP-PRRSV毒株91份，占總陽(yáng)性樣品數(shù)的76.5%；NADC30-like毒株28份，占總陽(yáng)性樣品數(shù)的23.5%(表3)。另外，在檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV和NADC30-like兩種毒株共同感染的樣品3份，2份來(lái)自廣州，1份來(lái)自湖北。

2.2 PRRSV ORF5基因同源性分析

所測(cè)得的53株GP5的氨基酸相似性為87.1%～100%，與北美型毒株VR-2332的氨基酸相似性為79.9%～96.6%，與HP-PRRSV代表株JXA1的氨基酸相似性為79.9%～96.6%，與類NADC30毒株代表株HENAN-XINX的氨基酸相似性為80.5%～93.3%。所測(cè)的這些序列在這3類亞型中都有分布。

2.3 PRRSV ORF5氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

所測(cè)得的53株P(guān)RRSV毒株均為美洲型毒株，美洲型PRRSV被分為9個(gè)lineage(亞系)，此次測(cè)得的53株分別從屬于lineage 1、3、5、8(圖1)。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 2.NADC-30 like PRRSV; 3.HP-PRRSV; 4.Classical PRRSV; 5～9.被檢樣品

2.4 PRRSV ORF5氨基酸序列比對(duì)分析

通過(guò)序列比對(duì)分析，可以看到GP5蛋白變異最大的區(qū)域位于1-25aa位的信號(hào)肽區(qū)域和27-30aa誘騙性表位區(qū)域，多序列在誘騙表位(27-30aa)存在氨基酸突變，由A29突變?yōu)閂29。主要中和表位PNE(37-45aa)處也存在氨基酸突變，HP-PRRSV毒株L39全部突變?yōu)镮39，2018HZAU-FJNP-419等多毒株的PNE處L39全部突變?yōu)镾39、H38全部突變?yōu)閅38(圖2)。

表3 2017-2018 PRRSV病料檢測(cè)結(jié)果

圖2 PRRSV ORF5基因進(jìn)化樹(shù)

圖3 PRRSV GP5蛋白質(zhì)序列分析(0-100)

3 討論

PRRSV基因組具有高度的變異性，極易獲得免疫逃避，給防控該病帶來(lái)極大困難，監(jiān)測(cè)PRRSV的流行情況和遺傳變異，對(duì)防控PRRS意義重大。2017年-2018年，共檢測(cè)了來(lái)自中國(guó)16省份76個(gè)豬場(chǎng)的309份臨床病料，結(jié)果顯示，PRRSV陽(yáng)性率38.51%，其中HP-PRRSV毒株91份，占總陽(yáng)性樣品數(shù)的76.5%；NADC30-like毒株28份，占總陽(yáng)性樣品數(shù)的23.5%。說(shuō)明在中國(guó)占主導(dǎo)地位仍然是HP-PRRSV毒株，其次為PRRSV NADC-30樣毒株。

我國(guó)已使用了7種減毒活疫苗(CH-1a/CH-1R、VR2332/Ingelvac PRRS MLV、R98/r998 MLV、JXA1/JXA1-r、TJ/TJM-F92、HuN4/HuN4-f112、GD/GDr180等)，不僅沒(méi)有取得很好地防控效果，還加速了PRRSV的變異。PRRSV基因重組不僅發(fā)生在疫苗毒株和野生毒株之間，甚至發(fā)生在兩個(gè)疫苗毒株之間[10]。部分毒株GP5的氨基酸與HP-PRRSV代表株JXA1的氨基酸相似性高達(dá)96.6%,毒株可重組來(lái)增加其多樣性。應(yīng)加強(qiáng)豬群混養(yǎng)前的毒株檢測(cè)避免PRRSV疫苗株的重組，并謹(jǐn)慎使用MLV疫苗。

由于ORF5 (GP5)高變異性，一直被作為PRRSV遺傳變異分析的目標(biāo)。GP5與免疫保護(hù)和免疫逃逸密切相關(guān)[11-12],對(duì)本研究中測(cè)得的53株P(guān)RRSVORF5基因推導(dǎo)的GP5氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道中常用的代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析，GP5蛋白變異最大的區(qū)域?yàn)?-25aa的信號(hào)肽區(qū)域和27-30aa誘騙性表位區(qū)域，多序列在誘騙表位(27-30aa)存在氨基酸突變，由A29突變?yōu)閂29。主要中和表位PNE(37-45aa)處也存在氨基酸突變，HP-PRRSV毒株L39全部突變?yōu)镮39，2018HZAU-FJNP-419等多毒株的PNE處L39全部突變?yōu)镾39、H38全部突變?yōu)閅38。這些突變可能與疫苗的免疫逃避有關(guān)，具體免疫逃避機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

HP-PRRSV和NADC-30樣毒株是國(guó)內(nèi)PRRS的主要致病毒株，應(yīng)開(kāi)展進(jìn)一步調(diào)查，全面了解PRRSV在中國(guó)的流行情況。與HP-PRRSV相比，NADC30樣PRRSV的ORF5在信號(hào)肽、主要線性表位和潛在的n-糖基化位點(diǎn)等重要區(qū)域發(fā)生了明顯的氨基酸置換。應(yīng)重視改良的活疫苗衍生物，有可能轉(zhuǎn)為毒株，使PRRSV的防控更加復(fù)雜。