白新棟，王晨驍，王 斌，吳 克，王小園，王 娟，黨如意，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

巴氏桿菌屬細(xì)菌是一類革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌，其菌體經(jīng)瑞氏染色、姬姆薩染色或美藍(lán)染色后，鏡檢可見典型兩極著色[1]。本屬細(xì)菌有13個(gè)種，許多種屬巴氏桿菌長期存在畜禽上呼吸道或消化道黏膜表面，作為條件致病菌繼發(fā)于其他傳染病或環(huán)境應(yīng)激，也可作為原發(fā)性病原給動(dòng)物造成嚴(yán)重?fù)p害，最具代表性的為多殺性巴氏桿菌，可引起多種動(dòng)物的出血性敗血癥和傳染性肺炎，而犬巴氏桿菌在獸醫(yī)臨床上的相關(guān)研究報(bào)道較少。根據(jù)其生化反應(yīng)能否產(chǎn)生吲哚，犬巴氏桿菌可分為2個(gè)生物型，犬巴氏桿菌生物1型能產(chǎn)生吲哚，主要存在于犬貓等動(dòng)物的口腔中，可經(jīng)咬傷途徑引起人的傷口化膿性炎癥、腹膜炎、骨關(guān)節(jié)炎、眼內(nèi)炎甚至全身性感染[2-6]；犬巴氏桿菌生物2型不能產(chǎn)生吲哚，主要引起牛的肺炎[7]。關(guān)于生物2型犬巴氏桿菌引起羊感染肺炎的病例在國內(nèi)未見報(bào)道，本病例從陜西省某奶山羊場獲得病死羔羊肺臟病料，由肺臟組織分離到1株生物2型犬巴氏桿菌，并對該菌株進(jìn)行了動(dòng)物致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2021年2月中旬陜西省某奶山羊場羔羊舍發(fā)生肺炎疫情，該羔羊舍存欄量約600只，發(fā)病率近50%，病死率約10%。病理剖檢可見死亡羔羊肺臟充血腫大、暗紅、肝樣變，伴有局部化膿灶及胸腔積液等病理變化，無菌采集病死羔羊的肺臟組織低溫保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷；6只SPF級昆明系小鼠購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 營養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；綿羊血采自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康綿羊；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片由本實(shí)驗(yàn)室參考?xì)W盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST 2017)自行制備并低溫保存；細(xì)菌DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；引物合成和產(chǎn)物測序由西安擎科生物公司完成；細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢 無菌操作剪取一小塊肺臟病變組織，用切面涂布接種于50 mL/L綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后擇優(yōu)勢菌再進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后挑取單菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察其形態(tài)。

1.2.1.2 生化鑒定 挑取純化培養(yǎng)后的單菌落，分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、蛋白胨水(加靛基質(zhì)1～2滴)、磷酸鹽葡萄糖胨水(加MR試劑1滴)、鳥氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，用封口膜封口，然后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～36 h，觀察其生化反應(yīng)并記錄。

1.2.1.3 PCR擴(kuò)增和16SrRNA基因測序及遺傳進(jìn)化分析 以分離菌株的DNA為模板，上下游引物選用細(xì)菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，以25 μL反應(yīng)體系按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，核對目的條帶大小后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果于NCBI官網(wǎng)上進(jìn)行Blast序列比對分析，并選取數(shù)據(jù)庫中部分菌株序列與分離菌株16SrRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)遺傳進(jìn)化分析，用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 小鼠致病性試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)物于無菌生理鹽水中以制備細(xì)菌懸液，利用細(xì)菌濁度儀將菌液濃度調(diào)至約1.5×108CFU/mL。將6只體重相近的小鼠隨機(jī)分成2組(n=3)，試驗(yàn)組小鼠每只腹腔注射0.2 mL菌液，對照組小鼠每只腹腔注射相同劑量的無菌生理鹽水，于相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，觀察小鼠狀態(tài)，如有死亡則對其進(jìn)行病理剖檢，并采取肺臟和肝臟再次進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，同時(shí)，對照組小鼠作相同處理。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 選取復(fù)方青霉素、復(fù)方阿莫西林、慶大霉素等18種抗菌藥物，用紙片擴(kuò)散法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會公布的獸用抗菌藥物耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌落特征與細(xì)菌形態(tài)

分離菌株在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，可見灰白色、水滴樣、表面光滑、邊緣整齊的小菌落，無溶血現(xiàn)象(圖1A)。革蘭氏染色鏡檢為陰性球菌或短桿菌，兩端鈍圓，多見單個(gè)存在，有的成對出現(xiàn)，偶見兩極著色(圖1B)。根據(jù)菌落形態(tài)和染色特征，初步診斷分離菌株為巴氏桿菌屬細(xì)菌。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)與細(xì)菌形態(tài)(1 000×)

2.2 生化鑒定結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管試劑盒操作規(guī)范對該分離菌株進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)(表1)，將生化試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版比對，表明該分離菌株疑似為犬巴氏桿菌。

表1 分離菌株的生化特性

2.3 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)進(jìn)化樹

將分離菌株進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增后，擴(kuò)增目的基因長度為1 300 bp，符合預(yù)期大小(圖2)。16SrRNA基因進(jìn)化樹分析表明該分離菌株與犬巴氏桿菌親緣關(guān)系最近聚為一支(圖3)，進(jìn)一步確定該分離菌株為犬巴氏桿菌，且根據(jù)上述吲哚試驗(yàn)陰性結(jié)果，判定其為生物2型犬巴氏桿菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～3.陽性對照、本試驗(yàn)菌株、陰性對照

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠注射菌液4 h后，開始出現(xiàn)呆立、畏寒扎堆等癥狀，并于12 h內(nèi)全部死亡，而對照組小鼠精神狀態(tài)良好。試驗(yàn)組死亡小鼠剖檢可見肺臟腫大、嚴(yán)重出血，呈現(xiàn)紅色肝變(圖4A)，肝臟淤血，呈膠凍樣腫大(圖4B)，對照組小鼠剖檢未見異常病理變化(圖4C、D)。試驗(yàn)組小鼠肺臟和肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，可再次獲得該生物2型犬巴氏桿菌，而對照組小鼠組織培養(yǎng)未能獲得生物2型犬巴氏桿菌。表明該分離菌株對小鼠有致病性，其導(dǎo)致的病理變化以肺臟和肝臟病變最具特征。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對阿莫西林、頭孢噻呋鈉、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、泰妙菌素敏感，對復(fù)方阿莫西林、氨芐青霉素、氨芐西林、替米考星中介，對鏈霉素、慶大霉素、安普霉素、泰萬菌素、泰樂菌素、多西環(huán)素、金霉素、土霉素、磺胺氯達(dá)嗪吶耐藥。

圖3 16S rRNA基因進(jìn)化樹

圖4 人工感染小鼠肺肝病變剖檢結(jié)果

3 討論

犬巴氏桿菌為重要人獸共患病病原[8]，犬、貓等動(dòng)物咬傷、傷口舔舐或與之密切接觸均可引起局部或全身感染[9-10]。犬巴氏桿菌也可引起犬傳染性心內(nèi)膜炎及新生幼犬的全身性感染[11-12]，以及貂的急性死亡[7]。上述病原多為生物1型犬巴氏桿菌，生物2型犬巴氏桿菌雖然以犬來命名，但其早期分離的宿主來源都為肺炎牛，生物2型犬巴氏桿菌與犢牛肺炎密切相關(guān)[13]，與牛密切接觸的艾滋病患者感染生物2型犬巴氏桿菌而導(dǎo)致淚囊炎[14]。從羊的鼻拭子、病死羊及屠宰羊肺臟中分離到的135株巴氏桿菌中有3株為生物2型犬巴氏桿菌，說明生物2型犬巴氏桿菌也可能在羊群中傳播。本文從某集約化養(yǎng)殖場羔羊舍的病死羊肺臟病料中分離到1株生物2型犬巴氏桿菌，小鼠致病性試驗(yàn)證明該菌株有致病性，且能造成肺臟嚴(yán)重出血、肝樣變，對比剖檢羔羊的肺臟嚴(yán)重肝變有相似之處。本文涉及的羔羊肺炎為群體發(fā)病，但生物2型犬巴氏桿菌在羊上的相關(guān)研究和病例報(bào)道太少，其在羊群中的傳播能力及致病性強(qiáng)弱存疑，且本次試驗(yàn)采集到的病料樣本數(shù)量太少，無法評估其傳染性。本實(shí)驗(yàn)室人員在同一份病料中進(jìn)行支原體檢測后，結(jié)果顯示山羊支原體肺炎亞種的PCR檢測為陽性，由此推測生物2型犬巴氏桿菌在羊體內(nèi)可能長期定殖，作為機(jī)會致病菌誘發(fā)于支原體感染或環(huán)境應(yīng)激。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株對阿莫西林、頭孢噻呋鈉、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、泰妙菌素均敏感，對復(fù)方阿莫西林、氨芐青霉素、氨芐西林、替米考星介于敏感與耐藥之間，對鏈霉素、慶大霉素、安普霉素、泰萬菌素、泰樂菌素、多西環(huán)素、金霉素、土霉素、磺胺氯達(dá)嗪吶均表現(xiàn)不同程度耐藥。該分離菌株對受試半數(shù)抗菌藥物均呈現(xiàn)耐藥性，說明該分離菌株已存在較為嚴(yán)重的多重耐藥性，該結(jié)果有助于指導(dǎo)針對生物2型犬巴氏桿菌感染癥的臨床用藥。