賀 瑩， 王雪菲

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000）

香菇，也被稱為花菇、冬菇、香菌等，其兼具食用和藥用功能，是含有豐富營(yíng)養(yǎng)的真菌（蔣敏等，2018）。研究表明，香菇多糖具有提高免疫力、降血糖血脂、抗輻射、抗病毒和抗氧化等廣泛的醫(yī)療保健功效，不僅對(duì)動(dòng)物的疾病防治有重要作用，而且可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料報(bào)酬，是一種天然綠色飼料添加劑（王秀文等，2021；雷莉輝，2017）。

酵母發(fā)酵法屬于較為新型的生物提取方法，提取過程中主要用到酵母菌、酶等。香菇中所含有的氨基酸等部分有機(jī)物可作為發(fā)酵過程中酵母菌生長(zhǎng)所需的養(yǎng)料， 在其生長(zhǎng)過程中消耗了發(fā)酵原料中多余的有機(jī)物， 目標(biāo)產(chǎn)物多糖的含量并不會(huì)減少，導(dǎo)致產(chǎn)物粗多糖中雜質(zhì)的含量降低，能夠提升產(chǎn)物多糖分離效率， 有利于原料的利用 （戚愛華，2018；萬茜淋等，2018）。目前，與其他傳統(tǒng)提取工藝相比，酵母發(fā)酵法提取香菇多糖還鮮見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)選取香菇多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件， 以期為畜禽生產(chǎn)上香菇多糖飼料添加劑提取研究提供參考 （湯強(qiáng)等，2020；鄯來平，2018）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 香菇： 購(gòu)買于呂梁農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；無水葡萄糖（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無蒽酮（分析純）：上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠；蔗糖（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；纖維素酶（生化試劑）：浙江仁和生物科技有限公司；中性蛋白酶（生化試劑）：南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 UV-1601 紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；L550 型臺(tái)式低速大容量離心機(jī)： 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱： 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；RE-5298 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的活化 稱取酵母粉5 g， 置于錐形瓶，向其中加入25 mL 蒸餾水，漩渦混合均勻，酵母粉于水中溶解均勻后，加入一定體積的濃度為5%的蔗糖溶液，再次振蕩混勻后，置于150 r/min、30 ℃的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)30 min（付麗娜等，2019）。

1.3.2 香菇多糖的提取及含量測(cè)定 將香菇置于恒溫干燥箱中進(jìn)行干燥， 烘干完成后用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40 目篩制得香菇粉。 取4 g 粉末于錐形瓶中，加入48 mL 蒸餾水，材料與液體的比例為1:12， 再向其中分別加入纖維素酶和中性蛋白酶0.02 g，混合均勻，于30 ℃環(huán)境中恒溫存放8 h，對(duì)香菇原料進(jìn)行酶解，隨即在高溫下對(duì)兩種酶進(jìn)行滅活，將滅活后的混合液冷卻至室溫。向混合液中添加一定量已活化的酵母液，置于30 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵16 h，發(fā)酵完成后，進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液進(jìn)行濃縮，向其中加入適量的無水乙醇，使乙醇濃度最終達(dá)到85%。醇沉后離心，收集沉淀物，再次真空干燥最終制得香菇粗多糖（聶小寶，2012；涂明鋒等，2018）。 采用蒽酮-硫酸法測(cè)定香菇多糖溶液在265 nm 處的吸光度，將其代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=10.517X+0.0321 R2=0.9969，計(jì)算出香菇多糖的量，并根據(jù)公式：香菇多糖得率/%=（香菇粗多糖中多糖量/香菇的干重）×100，計(jì)算出香菇多糖得率。

1.3.3 香菇多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 蔗糖添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 設(shè)置蔗糖添加量為 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/mL 五個(gè)因素水平。 采用酵母添加量0.75 mg/mL，設(shè)置發(fā)酵液 pH 為 6， 在 30 ℃環(huán)境中進(jìn)行 16 h 的發(fā)酵，在此條件下對(duì)香菇多糖進(jìn)行提取，探究不同蔗糖添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 （勞超等，2017；牛天增，2016）。

1.3.3.2 發(fā)酵液pH 對(duì)香菇多糖得率的影響 設(shè)置發(fā)酵液 pH 為 4、5、6、7、8 五個(gè)因素水平。 采用酵母添加量0.75 mg/mL，蔗糖添加量9.0 mg/mL，在30 ℃環(huán)境中進(jìn)行16 h 的發(fā)酵， 在此條件下對(duì)香菇多糖進(jìn)行提取， 探究不同發(fā)酵液pH 對(duì)香菇多糖得率的影響（陳文寧等，2021；李鑫，2018）。

1.3.3.3 酵母添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 設(shè)置酵母添加量為 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL五個(gè)因素水平。 采用蔗糖添加量9.0 mg/mL，設(shè)置發(fā)酵液 pH 為 6， 在 30 ℃環(huán)境中進(jìn)行 16 h 的發(fā)酵，在此條件下對(duì)香菇多糖進(jìn)行提取，探究不同酵母添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 （王振吉等，2019；郭毓菲，2018）。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取工藝設(shè)計(jì) 從蔗糖添加量、發(fā)酵液pH 和酵母添加量三個(gè)因素對(duì)酵母發(fā)酵法提取香菇多糖工藝的影響進(jìn)行研究。針對(duì)各因素對(duì)香菇多糖得率不同程度的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)， 最終結(jié)果采用Design Expert 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 并分析得出最優(yōu)提取工藝 （沈曉麗，2008；張潔媛等，2018），因素水平設(shè)置見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.4 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)樣品平行做三次，數(shù)據(jù)使用origin 9.0 作出折線圖， 采用Design-Expert 8.0.6.1 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 （李順峰，2020；趙詩雨等，2020）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母發(fā)酵法提取香菇多糖的單因素分析

2.1.1 蔗糖添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 由圖1 可知， 香菇多糖的得率隨著蔗糖添加量的增加而增加，在蔗糖添加量為9.0 mg/mL 時(shí)，曲線產(chǎn)生最高點(diǎn)，表明此時(shí)香菇多糖的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)添加蔗糖，其得率反而下降。 由此可得出香菇多糖提取最佳蔗糖添加量為9.0 mg/mL。

圖1 蔗糖添加量對(duì)香菇多糖得率的影響

2.1.2 發(fā)酵液pH 對(duì)香菇多糖得率的影響 由圖2 可知，香菇多糖的得率隨著發(fā)酵液pH 的增加而增加，在發(fā)酵液pH 為6 時(shí)取得最高點(diǎn)，此時(shí)香菇多糖的提取率達(dá)到最大， 隨著發(fā)酵液pH 的繼續(xù)升高，其得率反而下降。由此可得出香菇多糖提取最佳發(fā)酵液pH 為6。

圖2 發(fā)酵液pH 對(duì)香菇多糖得率的影響

2.1.3 酵母添加量對(duì)香菇多糖得率的影響 由圖3 可知， 香菇多糖的得率隨著酵母添加量的增加先增加，在酵母添加量為0.75 mg/mL 時(shí)取得最高點(diǎn)，此時(shí)香菇多糖的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)添加酵母其得率反而下降。 由此可得出香菇多糖提取最佳酵母添加量為0.75 mg/mL。

圖3 酵母添加量對(duì)香菇多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖提取工藝 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 提取條件優(yōu)化分析 運(yùn)用Design Expert軟件得出二次回歸方程： 香菇多糖得率=5.81+0.084A +0.036B +0.060C -0 .054AB -0.059AC +0.056BC-0.74A2-0.72B2-0.72C2。

回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表3。 由表 3 可知，A、C、A2、B2、C2的 “Pr＞F” 值均小于0.01， 故對(duì)香菇多糖提取率都有極顯著影響，B、AB、AC、BC 的“Pr＞F”值均小于 0.05，對(duì)香菇粗多糖得率有顯著的影響，各因素之間交互作用較好。模型的“Pr＞F”值小于 0.0001，且失擬檢驗(yàn)“Pr＞F”值大于0.05，不顯著，由此說明該回歸方程模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小。

表3 回歸模擬性顯著性檢驗(yàn)及方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析 由圖4 可知， 隨著蔗糖添加量、發(fā)酵液pH 的升高，香菇多糖提取量呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì)。 由圖5 可知， 隨著蔗糖添加量、酵母添加量的增加，香菇多糖提取量呈現(xiàn)逐漸升高再降低的趨勢(shì)。 由圖6 可知，隨著發(fā)酵液pH、酵母添加量的升高， 香菇多糖提取量呈現(xiàn)逐漸升高再降低的趨勢(shì)。隨著蔗糖添加量、酵母添加量增加，響應(yīng)曲面越陡峭，表明蔗糖添加量、酵母添加量因素作用對(duì)香菇多糖的提取影響較大。從圖4 ～圖6 可知，每組等高線近似橢圓，可以得出各組兩個(gè)交互因素的相互作用對(duì)多糖得率的影響較大，蔗糖添加量與酵母添加量交互作用、 發(fā)酵液pH與酵母添加量交互作用及蔗糖添加量與發(fā)酵液pH 交互作用強(qiáng)。

圖4 蔗糖添加量與發(fā)酵液pH交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖5 蔗糖添加量與酵母添加量交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖6 發(fā)酵液pH 與酵母添加量交互作用的響應(yīng)面與等高線

2.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)過Designer Expert 軟件的數(shù)據(jù)分析，可以得出酵母發(fā)酵法提取香菇多糖的最佳工藝條件為： 蔗糖添加量9.16 mg/mL，發(fā)酵液pH 6.02，酵母添加量0.76 mg/mL。在此最優(yōu)條件下香菇多糖理論得率為5.814%。對(duì)以上最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)， 在上述條件下進(jìn)行三次香菇多糖的提取， 多糖得率依次是5.791%、5.837%、5.783%， 計(jì)算得出三次提取結(jié)果的平均多糖提取率為5.804%， 與理論值的誤差較小，相差0.010%。 因此表明，響應(yīng)面法分析得到的此最優(yōu)工藝較為可靠。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖的提取工藝，結(jié)果表明，酵母發(fā)酵法提取香菇多糖的最優(yōu)工藝為：蔗糖添加量9.16 mg/mL，發(fā)酵液pH 6.02，酵母添加量0.76 mg/mL， 在此條件下香菇多糖理論得率為5.814%。 通過試驗(yàn)驗(yàn)證， 香菇多糖得率為5.804%，與軟件給出的理論值相近，表明模型擬合度良好，該工藝條件具有一定的參考性與可行性，可為后續(xù)飼料添加劑的開發(fā)和利用提供一定理論基礎(chǔ)，具有很大的發(fā)展前景。