王 琪 于曉銳 劉 云 楊曉琴 李麗萍 王軍民 趙 平,

（1. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233）

杉木（Cunninghamia laneolata）為杉科（Taxodiaceae）杉木屬（Cunninghamia）喬木，是我國(guó)長(zhǎng)江流域、秦嶺以南地區(qū)栽培最廣、生長(zhǎng)快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的用材樹種[1]，對(duì)杉木的研究多集中在生物學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)、化學(xué)成分以及木材應(yīng)用等方面[2-10]。杉木葉為條狀披針形，氣微香，味澀，具有祛風(fēng)、化瘀、活血、解毒等功效[11]，在民間常用于治療半身不遂初起、風(fēng)疹、咳嗽、牙痛、皰瘡、跌打損傷和毒蟲咬傷等[12-13]。已報(bào)道的杉木葉化學(xué)成分主要包括雙黃酮類[14-15]、半日花烷型二萜類[16-17]和揮發(fā)油類[18-20]等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗菌等生物活性[21-22]。高雪芹等[18]發(fā)現(xiàn)安徽產(chǎn)杉木葉醇提物的石油醚溶解組分中的主要揮發(fā)性成分為十八酸-1,3-甘油二酯、二十七烷、棕櫚酸-2-(十八烷氧基)乙酯、油酸和三十七醇等，Hsu等[19]發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣省產(chǎn)杉木葉揮發(fā)油中的主要成分為彌羅松酚、τ-杜松醇和α-杜松醇等。于曉銳等[20]發(fā)現(xiàn)浙江省產(chǎn)杉木葉的主要揮發(fā)性成分為α-蒎烯、β-月桂烯、β-石竹烯、d-檸檬烯、β-欖香烯和β-可巴烯等，且不同無性系杉木葉在揮發(fā)油的提取率、化學(xué)成分組成和含量上均存在一定差異。迄今為止，有關(guān)不同產(chǎn)地杉木葉揮發(fā)性成分的差異性分析比較則鮮有報(bào)道。

指紋圖譜是指在一定的實(shí)驗(yàn)條件下將待測(cè)物經(jīng)適當(dāng)處理后得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的譜圖，具有整體性和可量化的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制、食品評(píng)價(jià)、種子檢測(cè)和溯源鑒定等領(lǐng)域[23-25]。其中，GC-MS指紋圖譜檢測(cè)技術(shù)是國(guó)際上公認(rèn)的控制物質(zhì)品質(zhì)的最有效的手段之一[26]。楊俊杰等[27]通過GC-MS分析水杉（Metasequoia glyptostroboides）種子揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，并建立了由8個(gè)共有成分構(gòu)成的指紋圖譜，能夠較好反映產(chǎn)地差異情況。本研究以9個(gè)不同產(chǎn)地的37批杉木葉為原料，采用同時(shí)蒸餾-萃取法結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建杉木葉揮發(fā)性成分指紋圖譜，并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)（夾角余弦法）及化學(xué)模式識(shí)別（主成分分析和聚類分析）對(duì)杉木葉揮發(fā)性成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為杉木葉的快速溯源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

采集了杉科杉木屬植物杉木葉樣品共計(jì)37批次，經(jīng)陰干、粉碎，過3號(hào)篩處理后備用。各批次樣品的編號(hào)、采集時(shí)間和地點(diǎn)見表1，其中S1～S20為4種無性系杉木。無水乙醇、乙醚、正己烷均為分析純（購自廣東光華科技股份有限公司），超純水。

表 1 杉木葉樣品的來源Table 1 Sources of C. laneolata leaves samples

1.2 儀器與設(shè)備

890B-5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司，美國(guó)）；HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 μm×250 μm×0.25 μm，Agilent公司，美國(guó)）；中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安永歷制藥機(jī)械有限公司，中國(guó)）；BSA224S電子天平（精確到0.000 1 g，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品處理

采用同時(shí)蒸餾-萃取法[23]，分別稱取37批杉木葉粉末各20.00 g，置于同時(shí)蒸餾-萃取裝置中靜置浸泡60 min，提取180 min，收集正己烷萃取溶液，減壓濃縮干燥后稱量，取各萃取物樣品用正己烷溶解，0.45 μm濾頭過濾后供后續(xù)分析用。

1.3.2GC-MS分析條件

色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 mm ×250 mm × 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣形式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣為高純氦氣，恒流，柱流速1.0 mL/min；柱溫的起始溫度為50 ℃（保留2 min），以5 ℃/min升至220 ℃（保留10 min），運(yùn)行時(shí)間46 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，離子化電壓70 V，檢測(cè)器電壓0.9 kV，發(fā)射電流60 A，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃；掃描范圍15～500 amu，溶劑延遲4 min。

1.3.3方法學(xué)考察

1）空白試驗(yàn)：正己烷作為空白溶液，進(jìn)樣量1 μL，觀察溶劑正己烷出峰的情況，以及對(duì)杉木葉供試樣品的共有峰影響狀況。

2）精密度試驗(yàn)：取同一杉木葉供試樣連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

3）重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一杉木葉樣品，平行準(zhǔn)備3份供試樣，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD。

4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一杉木葉供試樣，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD。

5）質(zhì)控樣本制備方法：質(zhì)控樣品由所有檢測(cè)樣品混合而成，在樣本上機(jī)分析過程中，當(dāng)改變分析樣品產(chǎn)地時(shí)或達(dá)到5個(gè)樣本量時(shí)，插入1個(gè)質(zhì)控樣品進(jìn)樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用NIST MS數(shù)據(jù)庫對(duì)匹配度達(dá)到90%及以上的揮發(fā)性成分進(jìn)行譜庫檢索并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行定性分析，使用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。采用Origin Pro 8.1軟件建立GC-MS指紋圖譜，采用IBM SPSS Statistic 23.0軟件進(jìn)行相似度分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

空白試驗(yàn)中，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)正己烷溶劑的響應(yīng)值與供試樣品共有峰不在同一數(shù)量級(jí)，對(duì)樣品的檢測(cè)基本無影響，說明正己烷作為樣品溶劑的可行性。供試樣品溶液各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD=0.783 4%，共有峰相對(duì)峰面積比值的RSD=3.491 6%，兩者的RSD值均<5%，且在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)連續(xù)未間斷出峰，峰形的分離度高，證明該方法分離效率高、可重復(fù)性好、樣品及測(cè)試儀器運(yùn)行穩(wěn)定，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求，可用于構(gòu)建杉木葉指紋圖譜。

2.2 杉木葉中揮發(fā)性成分的分析與鑒定

對(duì)37批杉木葉樣品進(jìn)行GC-MS分析，共鑒定出140種揮發(fā)性成分，主要為烴類、醇類、酮類和其他類等（圖1）。其中，從浙江開化、貴州七星關(guān)、云南馬關(guān)、云南盈江、云南梁河、貴州大方、湖南湘潭、湖北麻城、福建南平杉木葉和混合樣品中分別鑒定出116種、76種、64種、84種、53種、62種、58種、57種、85種和69種。從采樣地點(diǎn)看，福建南平杉木葉中烴類的相對(duì)含量最高（19.93%），湖南湘潭樣品中醇類的相對(duì)含量最高（5.30%），浙江開化樣品中酮類的相對(duì)含量最高（2.93%），其他類別揮發(fā)性成分在貴州大方樣品中的相對(duì)含量最高（5.18%）。杉木葉中相對(duì)含量較高的揮發(fā)性成分主要有β-桉葉烯、α-蒎烯、氧化石竹烯、β-欖香烯、環(huán)封莰烯和3-蒈烯等。

圖 1 不同采集地杉木葉揮發(fā)性成分的相對(duì)含量和種類Fig. 1 Relative contents and classification of volatile components in C. lanceolata leaves from different areas

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

建立指紋圖譜的關(guān)鍵在于找到穩(wěn)定的特征峰和參照峰，特征峰根據(jù)色譜圖和色譜峰的保留時(shí)間確定，參照峰一般選取峰面積較大且相對(duì)穩(wěn)定的峰[28]。通過比較37批杉木葉的保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在4.0～46.0 min內(nèi)有30個(gè)共有峰，可作為杉木葉指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰。比較30個(gè)特征峰，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為7.37 min的峰相對(duì)穩(wěn)定且峰面積最大，可設(shè)為參照峰。將參照峰的保留時(shí)間和峰面積皆定為1，分別計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，以混合樣品的均值作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。

將37批杉木葉樣品的離子色譜圖原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro 8.1軟件后建立的杉木葉揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜，如圖2所示。37批杉木葉樣品在整體上有較高的相似性，出峰分離度較好且出峰完全，從相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)可以看出，不同產(chǎn)地的杉木葉，甚至相同產(chǎn)地的無性系杉木葉存在較大的差異。

2.4 相似度分析

夾角余弦值法分析是一種新型的指紋圖譜技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，將色譜指紋圖譜看作多維空間內(nèi)的向量，利用簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)公式計(jì)算指紋圖譜間的相似度[29]。以37批杉木葉樣本的相對(duì)峰面積歸一化數(shù)據(jù)為依據(jù)，采用計(jì)算向量夾角余弦值的方法進(jìn)行相似度分析，所得結(jié)果（表3）顯示，樣本的相似度基本上均達(dá)到0.8，證明相似度水平較高。但樣本S24所得夾角余弦值小于0.8，在保留時(shí)間為4.32、8.58、20.23～24.40、26.95 min的6個(gè)峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)均比參照峰峰面積大，說明出峰情況與其他批次樣品有較大區(qū)別。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1主成分分析

主成分分析是一種能夠?qū)⒍鄠€(gè)變量通過線性變換選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)方法[30]。將37批杉木葉樣品共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistic 23.0軟件中，選擇分析-降維-因子分析，得到前3個(gè)主成分的特征值分別為28.773、4.511和2.058（均大于1），方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)95.519%，超過80%，說明前3個(gè)主成分綜合了37批杉木葉樣品揮發(fā)性成分的絕大部分原始變量信息，能代表樣品揮發(fā)性成分的主要特征（表4）。從主成分分析得分圖（圖3）可知，樣品S2、S25、S28、S29、S30的主成分較為相近聚為1類；S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S16、S17、S18、S19、S20、S26的主成分相較于其他樣品較為相近，聚為第2類；S11、S12、S13、S14、S15、S21、S22、S23、S27、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37則聚為第3類，不同樣品的揮發(fā)性成分之間存在差異。由圖3可知，杉木葉樣本與質(zhì)控樣本聚合度較高，表明檢測(cè)條件穩(wěn)定，重復(fù)性好。主成分分析可將杉木葉進(jìn)行有效的區(qū)分，該結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果相一致。

圖 3 杉木葉樣品揮發(fā)性成分的得分圖Fig. 3 Score plots of on C. lanceolata leaves volatile components

表 3 37批樣品的向量夾角余弦值Table 3 The vector angle cosine of 37 groups of samples

表 4 主成分總方差解釋Table 4 Total variance explained

圖 2 杉木葉揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜Fig. 2 GC-MS fingerprinting of volatile components in C. lanceolata leaves

表 2 37 批杉木葉揮發(fā)性成分的相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of volatile components of 37 C. lanceolata leaves

2.5.2聚類分析

聚類分析是一種常用的指紋圖譜技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，針對(duì)沒有樣本所屬類別信息的物質(zhì)，以分類圖的形式進(jìn)行直觀地系統(tǒng)分析，可對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速分類或身份識(shí)別[31]。將37批杉木葉共有峰的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。S2、S25、S28、S29、S30聚為1類，S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S16、S17、S18、S20、S26聚為第2類，S11、S12、S13、S14、S15、S19、S21、S22、S23、S27、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37聚為第3類，該結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)及主成分分析結(jié)果一致。這3類都是以最小距離形成了聚類，表示它們之間的相似度最大。從整體上看，不存在較大差異的樣品，在指紋信息提取方面，37批樣品揮發(fā)性分析結(jié)果均不會(huì)對(duì)指紋圖譜的構(gòu)建造成較大影響，這也印證了樣品的同源性。

圖 4 杉木葉揮發(fā)性成分聚類樹狀圖Fig. 4 Cluster pedigree diagram of volatiles fromC. lanceolata leaves

3 結(jié)論

本研究對(duì)所建立的杉木葉揮發(fā)性成分GC-MS方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，該方法精密度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。并對(duì)9個(gè)不同產(chǎn)地37批杉木葉揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共鑒定出140種揮發(fā)性成分，其成分類型主要有烴類、醇類、酮類，相對(duì)含量較高的成分有β-桉葉烯、α-蒎烯、氧化石竹烯、β-欖香烯、環(huán)封莰烯和3-蒈烯等。比較了37批杉木葉樣品的色譜圖，結(jié)合夾角余弦法進(jìn)行分析，確定相對(duì)含量穩(wěn)定的30個(gè)峰為其特征值指紋峰，建立了杉木葉揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜。主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地杉木葉揮發(fā)性成分存在較大差異，并通過聚類分析能夠快速鑒定其產(chǎn)地來源。此外，同一產(chǎn)地不同品系揮發(fā)性成分亦略有不同，這一結(jié)果與于曉銳等[20]的報(bào)道較為相似。從生長(zhǎng)環(huán)境上看，浙江開化屬于丘陵地帶，云南馬關(guān)、盈江及梁河屬于山地高原，貴州七星關(guān)、大方、湖南湘潭、湖北麻城以及福建南平均屬于山地、高原向丘陵的過渡地帶，與主成分分析和聚類分析中分成的3類也基本吻合。本研究通過GC-MS指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)和化學(xué)模式識(shí)別能夠明確不同區(qū)域杉木葉揮發(fā)性成分的差異，為杉木葉的快速溯源提供了技術(shù)支撐。