姜 燕 李存玉 徐永江 柳學(xué)周 于超勇 王 濱 鄭 偉 史 寶

池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道和環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)對(duì)益生菌制劑的響應(yīng)*

姜 燕1李存玉2徐永江1柳學(xué)周1①于超勇3王 濱1鄭 偉4史 寶1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；2. 沂南縣水利局 山東 臨沂 276300；3. 山東省海洋生物研究院 山東 青島 266104；4. 山東寰達(dá)生態(tài)環(huán)境科技有限公司 山東 日照 276826)

為研究益生菌制劑對(duì)池塘養(yǎng)殖牙鲆()腸道及環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控效果，采用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段構(gòu)建牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體、餌料和池塘底泥的16S rDNA基因測(cè)序文庫(kù)，分析不同樣品中菌群組成和多樣性在益生菌制劑調(diào)控過(guò)程中的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，添加益生菌制劑后，池塘底泥和牙鲆腸道的菌群多樣性升高，且池塘底泥的菌群多樣性依然最高；而養(yǎng)殖水體的菌群多樣性明顯下降，并低于牙鲆腸道的。牙鲆腸道中的腸桿菌屬()、芽孢桿菌屬()相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，不動(dòng)桿菌屬()、發(fā)光桿菌屬()相對(duì)豐度先上升后下降；池塘養(yǎng)殖水體中NS3a_marine_group代表的菌屬相對(duì)豐度先下降后上升；底泥中芽孢桿菌屬相對(duì)豐度變化最為明顯，由最初的3.78%增加到33.64%。養(yǎng)殖牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體和底泥中的弧菌屬()相對(duì)豐度在益生菌制劑添加后出現(xiàn)不同程度的降低。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，不動(dòng)桿菌屬和弧菌屬中的部分菌株通常被認(rèn)為是重要病原菌。說(shuō)明益生菌制劑的添加能在一定程度上優(yōu)化魚(yú)體腸道和環(huán)境(養(yǎng)殖水體和池塘底泥)的菌群結(jié)構(gòu)。相似性分析發(fā)現(xiàn)，在餌料不變的條件下，牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)與底泥的更相近；且益生菌產(chǎn)品對(duì)池塘底泥和牙鲆腸道菌群的影響較為明顯。本研究結(jié)果可為池塘養(yǎng)殖過(guò)程中微生態(tài)制劑篩選和使用提供參考。

高通量測(cè)序；腸道菌群；牙鲆；池塘養(yǎng)殖；益生菌制劑

海水魚(yú)類(lèi)池塘高密度養(yǎng)殖條件下，以N、P為主的污染性代謝產(chǎn)物容易積累，一旦超過(guò)養(yǎng)殖池塘自身凈化能力，將導(dǎo)致養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、微生物和環(huán)境三者所構(gòu)成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的失調(diào)，極易暴發(fā)各種疾病。在我國(guó)大力推行綠色養(yǎng)殖的背景下，對(duì)待水產(chǎn)生物疾病的主要措施從以“治療”為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐浴胺揽亍睘橹?，因此，益生菌及其制劑、疫苗等生物防治方式備受關(guān)注(丁賢等, 2004; Merrifield, 2010; Luis- Villase?or, 2011; Buruian?, 2014; 徐奇友等, 2017)。益生菌制劑主要通過(guò)微生物的生態(tài)調(diào)控作用有效抑制外源菌群的入侵以維持生態(tài)環(huán)境內(nèi)菌群的動(dòng)態(tài)平衡，實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮、磷等污染物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化和再利用，構(gòu)建良性循環(huán)的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)。

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域常用的益生菌包括光合細(xì)菌、芽孢桿菌、硝化細(xì)菌、乳酸菌、EM菌等，以單一或復(fù)合添加的方式應(yīng)用于養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)控(丁賢等, 2004; Buruian?, 2014)。芽孢桿菌和乳酸菌是應(yīng)用較為廣泛的一類(lèi)益生菌，合理使用可以有效改善養(yǎng)殖水環(huán)境質(zhì)量，并維持養(yǎng)殖水生動(dòng)物消化道微生物的生態(tài)平衡，提高養(yǎng)殖動(dòng)物消化和免疫能力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)(Merrifield, 2010; Luis-Villase?or, 2011; 徐奇友等, 2017)。在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖應(yīng)用方面，已有研究表明，芽孢桿菌在調(diào)控養(yǎng)殖水質(zhì)(李健等, 2001; Fu, 2017; 張翠綿等, 2017)、促進(jìn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)(華雪銘等,2001; Merrifield, 2010; Liu, 2012; 徐奇友等, 2017)和調(diào)控養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)腸道菌群(Jiang, 2019b)等方面都起到了較好的效果。目前，國(guó)內(nèi)外利用益生菌等進(jìn)行海水魚(yú)類(lèi)池塘養(yǎng)殖方面的應(yīng)用研究較少。

本團(tuán)隊(duì)前期研制了一種益生菌制劑，發(fā)現(xiàn)其能有效降解池塘養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽和磷酸鹽(李存玉等, 2017)。本研究應(yīng)用該益生菌制劑對(duì)池塘養(yǎng)殖牙鲆()腸道和環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，以期揭示養(yǎng)殖水體和底泥沉積物以及腸道中的微生物群落變化規(guī)律與益生菌制劑調(diào)控的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)牙鲆池塘高密度養(yǎng)殖專(zhuān)用益生菌制劑和環(huán)境微生態(tài)調(diào)控技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)管理

益生菌制劑添加實(shí)驗(yàn)于2013年9—10月在山東省日照市水利養(yǎng)殖場(chǎng)(35.29°N, 119.44°E)進(jìn)行，選擇面積同為3300 m2，且同為泥沙底質(zhì)的2口養(yǎng)殖池塘，水深為2.0 m，分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。池塘內(nèi)養(yǎng)殖牙鲆平均體重為(282.0±24.23) g，平均體長(zhǎng)為(28.3± 1.93) cm，養(yǎng)殖密度均為4.5尾/m2。以鮮雜魚(yú)為餌料，每天投喂2次，投喂量為養(yǎng)殖魚(yú)體重的3%～5%，每天換水50%。實(shí)驗(yàn)期間，池塘養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)：水溫為21℃～23℃，鹽度為27～29，溶解氧(DO)≥5 mg/L，pH為7.8～8.7。

實(shí)驗(yàn)所使用的益生菌制劑為本實(shí)驗(yàn)室與日照市生態(tài)環(huán)境研究所聯(lián)合制備的產(chǎn)品，主要成分為腸桿菌屬()、芽孢乳桿菌屬()、乳桿菌屬()等有益微生物，有效活菌數(shù)不低于1.0×109CFU/g。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上制定益生菌制劑的施用策略：按照池塘水體1.0×105CFU/mL的添加量全池潑灑，每天上午添加1次，下午換水后補(bǔ)充1次，連續(xù)添加10 d，在第11～15天繼續(xù)追蹤相關(guān)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)共持續(xù)15 d；實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照池塘不添加益生菌制劑，只追蹤相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 樣品采集

在實(shí)驗(yàn)第1天添加益生菌制劑前、添加益生菌制劑后(第5、10、15天)分別對(duì)2個(gè)池塘的水體、底泥和養(yǎng)殖魚(yú)腸道進(jìn)行樣品采集，分析樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化。每次在上午投喂前，完成各種生物樣本的采集，采集方法如下：

腸道樣品：每次隨機(jī)撈取6尾體表無(wú)任何生理學(xué)病癥的健康牙鲆，采用MS-222 (Fluka, 美國(guó))麻醉后置于冰上，無(wú)菌條件下解剖，取其完整腸道，輕輕擠出腸道內(nèi)殘留的食糜，用預(yù)冷的無(wú)菌水沖洗腸道數(shù)次，分裝于無(wú)菌離心管中，并迅速放入液氮中保存。

底泥樣品：用采泥器采集池塘底泥，采集點(diǎn)分別位于進(jìn)水口、排水口和增氧機(jī)附近，每處采集3次樣品，將采集的每個(gè)池塘的底泥樣品充分混勻，并分裝于無(wú)菌離心管中，立即放入液氮中保存。

養(yǎng)殖水樣：用透明的卡蓋式采水器采集池塘水樣，分別于池塘進(jìn)水口、排水口和增氧機(jī)附近采集中層水樣，每處采集3次樣品，將采集的每個(gè)池塘的水樣充分混勻，混勻后水樣保留3 L，經(jīng)0.22 μm的濾膜真空抽濾后，將濾膜置于無(wú)菌離心管中，放入液氮保存。

餌料樣品：實(shí)驗(yàn)期間，投喂的鮮雜魚(yú)為購(gòu)買(mǎi)的同批貨源，使用無(wú)菌器械從中隨機(jī)取完整魚(yú)體5～8尾(全長(zhǎng)為10 cm左右)，無(wú)菌條件下剪成小段，液氮速凍后研磨成粉狀，充分混勻并平均分裝于無(wú)菌離心管中，液氮保存。

實(shí)驗(yàn)期間，將每次采集的樣品進(jìn)行編號(hào)、分類(lèi)保存，具體采樣時(shí)間與分類(lèi)編號(hào)情況見(jiàn)表1。

表1 樣品采集統(tǒng)計(jì)表

Tab.1 Samples collected for microbiota structure analysis

1.3 樣品微生物總DNA提取及高通量測(cè)序

將樣本從液氮中取出，其中，腸道樣本在液氮條件下研磨，每個(gè)池塘的6個(gè)平行樣本充分混勻，取一小部分樣品按照土壤微生物DNA提取試劑盒(OMEGA, 美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物總DNA提取；其余樣本置于冰上自然解凍后，參照說(shuō)明書(shū)提取微生物總DNA。針對(duì)微生物16S rDNA V3～V4可變區(qū)設(shè)計(jì)含barcode的特異引物(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國(guó))切膠回收PCR產(chǎn)物，并構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，采用Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析：利用uparse (version 7.1 http://drive5.com/uparse/)軟件平臺(tái)對(duì)處理后的序列進(jìn)行聚類(lèi)操作，采用RDP classifier (v2.2)對(duì)相似水平高于97%的可操作分類(lèi)單元(operational taconomic units, OTU)代表序列進(jìn)行歸類(lèi)分析，并在各個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成；利用Mothur (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_ diversity)進(jìn)行稀釋性曲線(xiàn)分析；分別利用香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和物種豐富度指數(shù)(ACE)評(píng)估微生物多樣性；利用R語(yǔ)言進(jìn)行主成分分析。利用Excel 2016軟件對(duì)菌群多樣性和相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品微生物多樣性水平分析

通過(guò)高通量測(cè)序與分析，平均每個(gè)樣本獲取15 400條有效序列，結(jié)合稀釋性曲線(xiàn)可以看出，實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)序結(jié)果是可靠的(圖1)。各樣品中微生物多樣性由高到低依次為池塘底泥、牙鲆腸道、池塘水樣、餌料、益生菌制劑。其中，池塘底泥樣品的香農(nóng)指數(shù)為4.96、物種豐富度指數(shù)為746，均為最高值，說(shuō)明微生物多樣性最高；同時(shí)，隨著實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，池塘底泥樣品的香農(nóng)指數(shù)和物種豐富度指數(shù)均呈先下降后上升的趨勢(shì)，第15天的多樣性指數(shù)均高于第1天。池塘水體中的微生物多樣性呈先下降后上升的趨勢(shì)，而腸道中微生物多樣性的變化較大，整體呈上升趨勢(shì)。益生菌制劑樣品的香農(nóng)指數(shù)和物種豐富度指數(shù)分別為1.64和80.7，均為最低值，說(shuō)明微生物多樣性最低(圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)樣品菌群稀釋性曲線(xiàn)

圖2 基于16S rDNA基因序列的微生物多樣性指數(shù)

2.2 實(shí)驗(yàn)池塘的牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體和底泥中菌群結(jié)構(gòu)的變化

在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)為牙鲆腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌群，隨著實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增大，梭桿菌門(mén)則相反(圖3)。藍(lán)藻門(mén)(Cyanophyta)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和變形菌門(mén)為養(yǎng)殖池塘水體中主要菌群，添加益生菌制劑后，藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度先上升后下降，與擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度變化完全相反，變形菌門(mén)相對(duì)豐度則逐漸下降。變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為池塘底泥的主要優(yōu)勢(shì)菌群，隨著實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行，變形菌門(mén)呈先下降后上升的趨勢(shì)，而厚壁菌門(mén)則相反。

在屬水平中，益生菌制劑中芽孢乳桿菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬為主要的菌群(圖4)。池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道樣品中，隨著實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行，芽孢桿菌屬()、腸桿菌屬的相對(duì)豐度逐漸升高，在第15天時(shí)，仍可檢測(cè)到腸桿菌屬；軍團(tuán)桿菌屬()相對(duì)豐度由2.95%增加到7.19%，不動(dòng)桿菌屬()、發(fā)光桿菌屬()和弧菌屬()相對(duì)豐度呈先上升后下降的趨勢(shì)。池塘養(yǎng)殖水體中的NS3a_marine_group相對(duì)豐度先下降后上升。池塘底泥中，芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度在添加益生菌制劑的第10天，由最初的3.78%增加到33.64%，之后明顯下降；脫硫疊球菌屬()由最初的3.34%先下降后迅速增加到8.62%；不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度在添加益生菌制劑的第5天，由最初的0.01%增加到13.15%，隨后大幅下降，至第15天時(shí)檢測(cè)不到；相對(duì)豐度由10.95%先下降，再上升至2.87%。牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體和底泥中的弧菌屬相對(duì)豐度均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。另外，在添加益生菌制劑的第5天，檢測(cè)到底泥樣品中出現(xiàn)腸桿菌屬(0.11%)，第10天相對(duì)豐度為0.05%，但在第15天(停止添加益生菌的第5天)時(shí)，底泥樣品中檢測(cè)不到腸桿菌屬。

2.3 對(duì)照池塘牙鲆腸道、養(yǎng)殖水體和底泥菌群結(jié)構(gòu)的變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道優(yōu)勢(shì)菌屬中Candidate_division_WS6-norank代表的菌屬相對(duì)豐度降低了40.98%，芽孢桿菌屬相對(duì)豐度相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)光桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬等優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度分別提高35.46%、64.05%和134.58% (圖5Ⅰ)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，實(shí)驗(yàn)池塘和對(duì)照池塘水體中的優(yōu)勢(shì)菌屬組成結(jié)構(gòu)相近，隨著實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行，對(duì)照池塘水體中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度變化較大，其中，NS3a_marine_ group、假交替單胞菌屬()、交替單胞菌屬()的相對(duì)豐度變化較為明顯，整體呈先下降后上升的趨勢(shì)(圖5Ⅱ)。同樣，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，實(shí)驗(yàn)池塘和對(duì)照池塘底泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬組成結(jié)構(gòu)相近，隨著實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行，池塘底泥中、芽孢桿菌屬、Candidate_division_WS6_norank等相對(duì)豐度變化較為明顯，其中，的相對(duì)豐度先上升后下降，而芽孢桿菌屬則完全相反(圖5Ⅲ)。

圖3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水體、牙鲆腸道和底泥樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)

圖4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)構(gòu)特征

圖5 對(duì)照組牙鲆腸道G1與G15(Ⅰ)、池塘水(Ⅱ)、和底泥(Ⅲ)優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)構(gòu)特征

2.4 池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要影響因子

通過(guò)主成分分析(PCA)可以看出，主成分1 (PC1)的貢獻(xiàn)率為55.98%，遠(yuǎn)高于主成分2 (PC2)的22.97%；牙鲆腸道樣品與餌料、底泥間的距離更為相近，說(shuō)明腸道中的菌群組成與餌料和底泥的相似；同時(shí)，與池塘水體相比，池塘底泥樣品與益生菌產(chǎn)品更為相近，說(shuō)明益生菌產(chǎn)品對(duì)池塘底泥微生物組成影響較大(圖6)。

在屬水平上，通過(guò)對(duì)各樣品中菌群的組成與豐度信息進(jìn)行分析，可以看出，牙鲆腸道樣品與餌料和底泥中的菌群組成更為相近，其次是水環(huán)境樣本，而益生菌制劑與牙鲆腸道菌群組成相似性最小(圖7)。但益生菌制劑與底泥和水環(huán)境中菌群組成較為相近。說(shuō)明益生菌產(chǎn)品對(duì)除餌料外的牙鲆養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群影響較大。

圖6 不同樣品主成分分析

3 討論

3.1 微生物多樣性變化

微生物多樣性指數(shù)顯示，在添加益生菌制劑以后，池塘水樣和底泥樣品微生物多樣性呈先下降后升高的趨勢(shì)，養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯的改變，這與王新等(2014)對(duì)微生態(tài)制劑改善蝦池水質(zhì)及微生物群落的研究結(jié)果一致。添加益生菌制劑初期，池塘水體和底泥中微生物多樣性降低，一方面可能是添加的菌種大量繁殖，抑制了某些定植菌的生長(zhǎng)(張睿等, 2014)；另一方面可能是添加的益生菌雖然本身繁殖數(shù)量有限，但可直接或間接的導(dǎo)致某些定植菌成為優(yōu)勢(shì)菌，并抑制某些豐度極低的定植菌生長(zhǎng)繁殖，改變?cè)械木航Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物多樣性降低。在菌群結(jié)構(gòu)與組成信息方面，實(shí)驗(yàn)中施用的益生菌制劑主要由腸桿菌屬和乳桿菌屬等組成，然而，這些菌屬在養(yǎng)殖牙鲆池塘水體和底泥中檢出量極低(圖4)，表明前期微生物多樣性下降的原因應(yīng)為后者。添加益生菌制劑后期，池塘系統(tǒng)通過(guò)自我調(diào)節(jié)作用，使得菌群結(jié)構(gòu)維持在一個(gè)新的平衡狀態(tài)，微生物多樣性升高。牙鲆腸道樣品中微生物多樣性相對(duì)比較穩(wěn)定，這可能是因?yàn)橄鄬?duì)于池塘水體和底泥，腸道為其定植微生物提供了一個(gè)相對(duì)封閉的微生態(tài)環(huán)境，通過(guò)宿主的生理功能，使腸道菌群具有能維持其定植后平衡狀態(tài)的內(nèi)在機(jī)制，可抵御外部環(huán)境對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)造成的影響。

圖7 基于菌群相對(duì)豐度的Heatmap

3.2 牙鲆腸道和環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)變化分析

本研究顯示，添加益生菌制劑后，池塘水體中藍(lán)藻門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度增加，藍(lán)細(xì)菌是能進(jìn)行光合作用的大型原核微生物，其相對(duì)豐度的增加在一定程度上提高了養(yǎng)殖水體中DO的含量，能有效降低高密度集約化養(yǎng)殖條件下因缺氧引起的生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。池塘底泥中芽孢桿菌屬的變化最為明顯，其相對(duì)豐度的增加有助于提高養(yǎng)殖魚(yú)對(duì)餌料的利用率及其生長(zhǎng)性能(Bairagi, 2004)；添加益生菌制劑期間，底泥中能檢測(cè)到腸桿菌屬，停止添加益生菌制劑后檢測(cè)不到腸桿菌屬菌群，研究表明，底泥中的腸桿菌屬來(lái)自添加的益生菌制劑(圖4)，之后經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)，其為產(chǎn)氣腸桿菌()(待發(fā)表)。關(guān)于產(chǎn)氣腸桿菌的研究既有其致病性方面的報(bào)道(徐風(fēng)亮等, 2007)，也有關(guān)于其通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)有用生物衍生品[乳酸、生物氫、多羥基烷酸酯(PHA)、鼠李糖酯等]、降低發(fā)酵成本等方面的報(bào)道(徐忠義等, 2011; Arumugam, 2014、2020; Song, 2020)。不動(dòng)桿菌屬在醫(yī)學(xué)界被認(rèn)為是重要的病原菌(Lynch, 2017; Wong, 2017)；在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中也分離得到一些不動(dòng)桿菌屬的菌株(.、.、和等)，并且其中的某些致病種類(lèi)能夠耐受多種藥物(Reddy, 2013; Kozińska, 2014; Li, 2017)?；【鷮僦械拇蟛糠志暝谒a(chǎn)養(yǎng)殖中被認(rèn)為是常見(jiàn)的病原菌(Baker-Austin, 2018; 胡秀彩等, 2019)。本研究中，對(duì)照池塘牙鲆腸道中弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬等相對(duì)豐度明顯升高，而這些菌屬相對(duì)豐度在實(shí)驗(yàn)池塘牙鲆腸道中則出現(xiàn)一定程度的降低；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)池塘牙鲆腸道中的中腸桿菌屬相對(duì)豐度升高。這可能是因?yàn)橐嫔苿┲械牟糠治⑸镫m然不能在腸道中成功定植，但是，它們能通過(guò)產(chǎn)物抑制等作用一定程度調(diào)控腸道菌群的穩(wěn)態(tài)；并且能在腸道中定植的部分益生菌通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、粘附位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)等模式有效抑制有害菌的繁殖。雖然牙鲆腸道內(nèi)定植有弧菌、不動(dòng)桿菌等多種病原菌，并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度在一定階段內(nèi)有所升高，但魚(yú)體始終未出現(xiàn)任何病癥，活力也非常好，說(shuō)明健康魚(yú)體內(nèi)有病原菌的存在屬正常現(xiàn)象(Reddy, 2013; Jiang, 2019a; 姜燕等, 2020)。在正常魚(yú)體的生理活動(dòng)中，這些病原菌的豐度在安全范圍內(nèi)，并且魚(yú)體內(nèi)的微生態(tài)處于平衡狀態(tài)。在添加益生菌制劑期間，養(yǎng)殖魚(yú)腸道內(nèi)能檢測(cè)到乳桿菌，但其在牙鲆腸道中的相對(duì)豐度小、變化不穩(wěn)定，而腸桿菌屬相對(duì)豐度升高，反應(yīng)出定植菌(腸桿菌屬)和外源菌(乳桿菌屬)在腸道中相對(duì)豐度變化的本質(zhì)區(qū)別，也表明腸道菌群具有維持其定植后平衡狀態(tài)的本質(zhì)。Skjermo等(2015)將從大西洋鱈魚(yú)()腸道內(nèi)分離得到的益生菌通過(guò)水和餌料2種途徑進(jìn)行添加，結(jié)果均未在鱈魚(yú)腸道內(nèi)檢測(cè)到該菌。Jiang等(2019b)以生物餌料為載體進(jìn)行大菱鲆()幼魚(yú)源益生菌的添加，發(fā)現(xiàn)益生菌雖未在大菱鲆仔稚幼魚(yú)消化道中成功定植，但其益生作用卻成功傳遞到了仔稚幼魚(yú)消化道中。同樣，在本研究中，雖然益生菌制劑中的部分菌群未能在池塘各個(gè)容納體(牙鲆、水和底泥)中成功定植，但它們優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)的“益生”功能卻得以有效傳遞。再者，益生菌制劑中腸桿菌屬的部分菌株為亞硝化反硝化聚磷菌，被廣泛應(yīng)用于廢水處理(張立成等, 2012)?？赡芤舱怯捎谝嫔蚱渲苿┑摹耙嫔弊饔茫环矫娓纳蒲丽夷c道菌群結(jié)構(gòu)，一定程度促進(jìn)飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)的有效利用，降低N、P排放；另一方面，益生菌本身參與到池塘養(yǎng)殖環(huán)境中N、P的降解過(guò)程，最終使得池塘水體中N、P化合物(氨氮、磷酸鹽等)的濃度得到有效降解。本研究認(rèn)為，一定濃度的益生菌制劑能直接或間接的影響?hù)~(yú)體腸道和池塘環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)，改善養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量，短期效果明顯，在投喂餌料沒(méi)有改變的情況下，可加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)牙鲆的影響，引起牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，促進(jìn)牙鲆健康生長(zhǎng)。

益生菌制劑對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。本研究中，對(duì)照組池塘水環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)變化較大，但改變屬于自然水體的正常波動(dòng)，而實(shí)驗(yàn)組池塘水體中的優(yōu)勢(shì)菌屬的組成在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中相對(duì)比較穩(wěn)定，說(shuō)明益生菌制劑的施用有助于養(yǎng)殖水環(huán)境微生物群結(jié)構(gòu)的統(tǒng)一與穩(wěn)定。對(duì)照組池塘底泥中的菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定，而施用益生菌制劑后底泥中菌群結(jié)構(gòu)變化較明顯，尤其是芽孢桿菌屬、脫硫疊球菌屬等相對(duì)豐度的迅速變化，表明益生菌制劑對(duì)池塘底泥菌群具有一定的調(diào)控作用。對(duì)照組池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)一定程度的變動(dòng)，也表明了牙鲆腸道定植菌群結(jié)構(gòu)雖然會(huì)同環(huán)境菌群一起出現(xiàn)波動(dòng)，但是這些波動(dòng)在平衡狀態(tài)的范圍之內(nèi)，反映了腸道對(duì)其定植菌群平衡狀態(tài)的維護(hù)功能；實(shí)驗(yàn)組池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化表明了益生菌制劑的重要調(diào)控作用。本研究設(shè)置了對(duì)照組的橫向比較及實(shí)驗(yàn)組添加益生菌制劑前后的縱向比較，使數(shù)據(jù)具有說(shuō)服力，通過(guò)對(duì)牙鲆腸道及生長(zhǎng)環(huán)境中微生物種類(lèi)、數(shù)量變化及相關(guān)影響因子的測(cè)定，初步分析了益生菌制劑對(duì)池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群的調(diào)控機(jī)制?？赡苷怯捎谶@種調(diào)控作用，使養(yǎng)殖牙鲆對(duì)餌料的消化吸收能力得以提高，從而排放到養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽等的含量減少，促進(jìn)水產(chǎn)綠色養(yǎng)殖的發(fā)展。對(duì)于益生菌制劑調(diào)控過(guò)程中，池塘養(yǎng)殖牙鲆消化和免疫等理化因子的應(yīng)答變化及機(jī)制是今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容，將從多角度綜合解析益生菌制劑的調(diào)控機(jī)制。

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Responses of Microbiota Structure in the Intestinal Tract and Pond Culture Environment of Japanese Flounder () to Probiotics

JIANG Yan1, LI Cunyu2, XU Yongjiang1, LIU Xuezhou1①, YU Chaoyong3, WANG Bin1, ZHENG Wei4, SHI Bao1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China; 2. Yi′nan County Water Conservancy Bureau, Linyi, Shandong 276300, China; 3. Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao, Shandong 266104, China; 4. Shandong Huanda Ecological Environment Technology Co. LTD, Rizhao, Shandong 276826, China)

The deterioration of the aquaculture environment and disease outbreaks occur often in high-density pond cultures of fish. Probiotics are the main and efficient method to regulate the microbiota of the fish intestinal tract and pond water environments, which will improve aquaculture conditions and reduce the incidence of diseases. To investigate the effects of probiotics on the composition and diversity of microbiota in the intestinal tract and pond culture environment of the Japanese flounder (), samples from the Japanese flounder intestinal tract and environmental media (culture water, feed, and pond sediment) were collected. High-throughput sequencing of the 16S rDNA genes was performed to analyze the regulation of the microbiota of the intestinal tract and environmental samples by probiotics.Our results showed that the diversity of microbiota in the pond sediment and intestinal tract of Japanese flounder increased after the addition of probiotics, and was still in the pond sediment. Inversely, the diversity of the microbiota in the culture water declined, which was lower than that in the intestinal tract. Firmicutes, Proteobacteria, and Fusobacteria were dominant in the Japanese flounder intestinal tract, and the relative abundances of Firmicutes and Proteobacteria increased, whereas Fusobacteria decreased after the addition of probiotics. At the genus level, the relative abundances ofandincreased, whereasandfirst increased and then decreased in the intestinal tract. The relative abundance of genus represented by NS3a_marine_group firstly decreased and then increased in the Japanese flounder culture water. In the pond sediment, the change in the relative abundance ofwas obvious, increasing from 3.78% to 33.64%. The relative abundances ofin the fish intestinal tract, culture water, and pond sediment decreased after the addition of probiotics. Some strains ofandare important pathogens in aquaculture. The microbiota structure in the intestinal tract of Japanese flounder was similar to that in the pond sediment.Changes in the relative abundances of these main microbiota indicated that the addition of probiotics could optimize the microbiota structure of the Japanese flounder intestinal tract and environment. However, it is impossible that, as the main microbiota of the probiotics, was able to colonize and persist in the fish intestinal tract, water, and pond sediment, which indicated that probiotics did not deliver bacteria but their probiotic function. Hence, the addition of probiotics could affect the microbiota structure of the Japanese flounder intestinal tract, water, and pond sediment.

High throughput sequencing;Intestinal tract microbiota;; Pond culture; Probiotics

LIU Xuezhou, E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

S917.1

A

2095-9869(2022)02-0137-10

10.19663/j.issn2095-9869.20210224006

* 山東省支持青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2018SDKJ0501-2)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)課題(2019XT0402, TD47)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022021011)和財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系共同資助 [This work was supported by Marine S&T Fund of Shandong Province for Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2018SDKJ0501-2), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2019XT0402, TD47), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022021011), and China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-47)].

姜 燕，E-mail: jiangyan@ysfri.ac.cn

柳學(xué)周，研究員，E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

2021-02-24,

2021-04-02

姜燕, 李存玉, 徐永江, 柳學(xué)周, 于超勇, 王濱, 鄭偉, 史寶. 池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道和環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)對(duì)益生菌制劑的響應(yīng). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(2): 137–146

JIANG Y, LI C Y, XU Y J, LIU X Z, YU C Y, WANG B, ZHENG W, SHI B. Responses of microbiota structure in the intestinal tract and pond culture environment of Japanese flounder () to probiotics. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(2): 137–146

(編輯 馬璀艷)