魏宇靖 潘婕 柯波 符環(huán) 萬才水 丁偉榮 程洪波

1江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科（南昌330006）；2江西省血液腫瘤細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南昌330006）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種常見的惡性血液腫瘤，主要表現(xiàn)為骨髓中髓系原始細(xì)胞惡性增生，導(dǎo)致骨破壞、骨髓造血衰竭和多個(gè)器官組織損傷。AML 好發(fā)于老年人，中位發(fā)病年齡為68 歲［1］，60 歲以上的老年患者預(yù)后較差，只有2.4%的患者能達(dá)到診斷后10年的無病存活。AML 復(fù)發(fā)和耐藥仍不可避免，具有高度的異質(zhì)性，在過去的許多年里，隨著新藥的問世以及新型治療策略的發(fā)展，AML 的治療也取得一定的進(jìn)步。盡管異基因造血干細(xì)胞移植認(rèn)為是至今AML 治愈的唯一途徑，但是仍可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，新的治療策略和新藥的研發(fā)仍亟待問世。

原癌基因Myc（cMyc）是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，其與MAX 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異二聚體，與E-box DNA 結(jié)合區(qū)域結(jié)合調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，參與細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等細(xì)胞進(jìn)程［2-3］。大約20%的腫瘤與cMyc 的表達(dá)相關(guān)，其在惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用［3］。10058-F4 是一種靶向cMyc 蛋白的小分子抑制劑，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制及促凋亡作用。有研究結(jié)果表示，cMyc 蛋白的上調(diào)表達(dá)通過調(diào)節(jié)K562 細(xì)胞上的NKG2D 配體的表達(dá)，促進(jìn)逃避NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答［4］。cMyc 通過結(jié)合PD-L1 基因啟動(dòng)子，調(diào)控腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡-配體1（PD-L1）基因的表達(dá)，并且兩者在食道鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平具有相關(guān)性［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道cMyc抑制劑10058-F4 可以通過調(diào)控多種信號(hào)途徑促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，但仍未完全闡明其作用機(jī)制。因此，本研究通過cMyc 抑制劑10058-F4 處理急性單核細(xì)胞白血病THP1 細(xì)胞，熒光探針染色分析細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位變化，Western blot 檢測與DNA 損傷和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人急性單核細(xì)胞白血病THP1 細(xì)胞株購于南京凱基公司，cMyc 抑制劑10058-F4 購于上海源葉公司；胎牛血清購于Gibco 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素購于北京索萊寶公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購于無錫耐思特公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購于上海AbMole公司；JC-1 熒光染料購于上海翊圣公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；Calcein∕PI 檢測試劑盒購于上海碧云天公司。兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Bcl2 相關(guān)X 蛋白（BAX）、成熟型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、磷酸化毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白（pATM）和磷酸化組蛋白H2A.X（γH2AX）一抗和羊抗兔標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）二抗購于美國abcam 公司。Western 一抗稀釋液和封閉液購于上海碧云天公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海碧云天公司；倒置熒光顯微鏡購于德國徠卡公司；酶標(biāo)儀購于美國賽默飛公司；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購于日本三洋公司；垂直電泳槽和半干轉(zhuǎn)膜儀購于美國BioRad 公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人急性單核細(xì)胞白血病THP1 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，用新鮮培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后鋪種于96孔或者12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2.2 細(xì)胞生長抑制檢測 THP1 細(xì)胞用培養(yǎng)液懸浮并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至1 × 106細(xì)胞∕mL，加入終濃度為1、5、10、50、100 μmol∕L 的cMyc 抑制劑10058-F4，對(duì)照組加入等體積二甲基亞砜（DMSO），取100 μL 鋪種于96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)12 h和24 h 后每孔加入CCK-8 試劑，孵育2 h 后檢測450 nm 處的吸光度（OD450），比較不同濃度cMyc抑制劑10058-F4 對(duì)THP1 細(xì)胞的抑制率，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 Calcein/PI 熒光染色分析細(xì)胞凋亡 按照上述方法懸浮細(xì)胞，分別加入不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L），并取2 mL接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞并用PBS 緩沖液清洗，加入Calcein∕PI 檢測工作液，37 ℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞并用PBS 緩沖液清洗，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇后固定細(xì)胞24 h，用PBS 緩沖液清洗后按照說明書要求加入RNase（50 μg∕mL），37 ℃水浴30 min，PBS 清洗后400 μL PI（50 μg∕mL），4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.5 JC-1 細(xì)胞線粒體膜電位檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集并清洗細(xì)胞。并用0.5 mL 新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，混勻后37 ℃避光孵育20 min，用JC-1 染色緩沖液清洗細(xì)胞2 次，用適量緩沖液重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot檢測 按照上述方法懸浮并鋪種細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞并加入RAPI細(xì)胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解2 h 后用BCA 法定量樣品的蛋白濃度。每孔道取20 μg 的樣品上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，于封閉液中室溫封閉2 h；4 ℃一抗孵育過夜，PBST 漂洗4 次，每次7 min；用二抗室溫孵育2 h，PBST 漂洗4 次；用配置好的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液孵育PVDF 膜，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影拍照，用Image J 圖像分析軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶光密度比值，得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cMyc抑制劑10058-F4抑制THP1細(xì)胞增殖 采用CCK-8 方法對(duì)THP1 細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L）處理THP1 細(xì)胞12 h 和24 h 后，均對(duì)THP1 細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，該抑制作用隨著cMyc 抑制劑10058-F4 濃度增加抑制效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，cMyc 抑制劑10058-F4 處理THP1 細(xì)胞24 h 后的抑制作用明顯高于12 h 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 cMyc 抑制劑10058-F4 不同濃度和作用時(shí)間對(duì)THP1細(xì)胞生長抑制率的影響Fig.1 The effects of cMyc inhibitor 10058-F4 with different concentrations and time on growth inhibition rate of THP1 cells

2.2 cMyc抑制劑10058-F4誘導(dǎo)THP1細(xì)胞凋亡 Calcein∕PI 熒光染色結(jié)果顯示，cMyc 抑制劑10058-F4 處理處理后，PI 陽性細(xì)胞隨著藥物濃度的增高而增加。Calcein 染色代表細(xì)胞活力，染色結(jié)果顯示低濃度（1 μmol∕L 和5 μmol∕L）組中Calcein 熒光強(qiáng)度與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度組（10、50、100 μmol∕L）中Calcein 熒光強(qiáng)度明顯減弱低。結(jié)果提示cMyc 抑制劑10058-F4 可降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞的凋亡，見圖2。

圖2 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞凋亡Fig.2 The cMyc inhibitor 10058-F4 induces apoptosis of THP1 cells

2.3 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞中線粒體膜電位下降 THP1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，經(jīng)過線粒體膜電位熒光探針（JC-1）的加載，通過熒光顯微鏡觀察熒光的變化，反映細(xì)胞線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4 處理THP1 細(xì)胞后紅素?zé)晒庵饾u減弱，綠色熒光增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度（MFI）比值逐漸降低，提示線粒體膜電位出現(xiàn)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。結(jié)果表明cMyc 抑制劑10058-F4 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞凋亡可能是通過降低線粒體膜電位所介導(dǎo)。

圖3 cMyc 抑制劑10058-F4 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞線粒體膜電位下降Fig.3 The cMyc inhibitor 10058-F4 induced a decrease in mitochondrial membrane potential in THP1 cells

2.4 cMyc 抑制 劑10058-F4 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期阻滯 THP1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果顯示不同濃度的cMyc 抑制劑10058-F4處理THP1 細(xì)胞后，S 期細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組，G1 期細(xì)胞細(xì)胞比例低于對(duì)照組，G2∕M 期細(xì)胞比例隨著藥物濃度逐漸上升，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示10058-F4對(duì)THP1 細(xì)胞可能具有DNA 損傷誘導(dǎo)作用，見圖4。

2.5 cMyc 抑制劑F410058 誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞凋亡和DNA 損傷相關(guān)蛋白的表達(dá) THP1 細(xì)胞經(jīng)cMyc 抑制劑10058-F4 處理24 h 后，Western blot 檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示不同濃度的cMyc抑制劑10058-F4 處理后，促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，參與DNA損傷應(yīng)答蛋白γH2AX 和pATM 的表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，并隨著藥物濃度逐漸上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖5。結(jié)果提示cMyc 抑制劑10058-F4 可能誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞DNA 損傷，激活P53 相關(guān)信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 cMyc 抑制劑10058-F4 對(duì)THP1 細(xì)胞凋亡和DNA 損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of the cMyc inhibitor 10058-F4 on the protein expression associated with apoptosis and DNA damage in THP1 cells

3 討論

AML 是一種目前尚未能治愈的惡性血液腫瘤，AML 的顯著特征為疾病的克隆性進(jìn)展。雖然化療和造血干細(xì)胞移植為代表的治療策略能提高緩解率，但仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)以及藥物耐受，特別是老年患者由于存在基礎(chǔ)疾病，治療反應(yīng)性差，需要進(jìn)行個(gè)體化治療［6］。cMyc 作為原癌基因，在多種腫瘤和血液腫瘤中高表達(dá)或者存在突變，其作為轉(zhuǎn)錄因子與Max 形成異二聚體，并與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特異的E-box DNA 序列結(jié)合［7］。小分子化合物可以通過抑制cMyc-MAX 復(fù)合物的形成，降低cMyc 的轉(zhuǎn)錄活性并導(dǎo)致其靶基因表達(dá)受阻，從而影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡［8］。Myc 可以促進(jìn)壁龕中的造血干細(xì)胞進(jìn)入增殖祖細(xì)胞狀態(tài)，cMyc 蛋白的表達(dá)將介導(dǎo)細(xì)胞周期快速進(jìn)入G1 期，其后表達(dá)下調(diào)，從而參與細(xì)胞周期調(diào)控［9］。cMyc 受核因子κB（NF-κB）信號(hào)途徑調(diào)控，IκB 激酶（IKK）復(fù)合物中IKKα 和IKKβ 與cMyc 結(jié)合，并通過催化其S67 和S71 磷酸化位點(diǎn)增強(qiáng)其穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄翻譯抗凋亡蛋白發(fā)揮其抗凋亡作用［10］。cMyc 作為Flt3-ITD 信號(hào)的下游靶標(biāo)，F(xiàn)lt3-ITD 通過Wnt 信號(hào)途徑調(diào)控cMyc，而且Flt3-ITD 還可以抑制Myc 拮抗物Mxi-1 從而增強(qiáng)Myc 活性，高三尖杉酯堿聯(lián)合奎扎替尼可以通過抑制FLT3-AKT-cMyc 信號(hào)途徑增強(qiáng)FLT3-ITD 急性髓系白血病細(xì)胞體外治療效果［11-12］。多肽類抑制劑OmoMYC 可以抑制三種MYC 蛋白與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，發(fā)揮抗腫瘤作用明顯且副作用少，并且以及進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。APTO-253 抑制劑通過抑制MYC 基因的表達(dá)水平，用于復(fù)發(fā)∕難治性AML 和骨髓異常綜合征的治療，也進(jìn)入了I 期臨床試驗(yàn)階段［13-14］。

THP1 細(xì)胞來源于急性單核細(xì)胞白血病患者，其屬于AML 中一種亞型，攜帶CSNK2A1-DDX39B融合基因［15］。本研究應(yīng)用CCK-8 和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，分析cMyc 抑制劑10058-F4 對(duì)THP1 細(xì)胞的生長抑制及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 ～100 μmol∕L 濃度的cMyc 抑制劑F410058 呈濃度依賴性地抑制THP1 細(xì)胞增殖；熒光探針染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1 ～100 μmol∕L 的cMyc 抑制劑10058-F4處理組細(xì)胞中Calcein 熒光強(qiáng)度逐漸降低，活性細(xì)胞數(shù)也明顯降低，PI 陽性細(xì)胞數(shù)比例明顯高于對(duì)照組，提示cMyc 抑制劑10058-F4 對(duì)THP1 細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。cMyc 抑制劑10058-F4 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是其作用機(jī)制仍未闡明，本研究通過JC-1 熒光探針加載細(xì)胞，熒光顯微鏡分析THP1 細(xì)胞線粒體膜電位水平變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示cMyc 抑制劑10058-F4 處理后紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，提示線粒體膜電位隨著藥物濃度增加而逐漸下降。cMyc 抑制劑10058-F4 可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中FOXO 家族基因mRNA 水平的表達(dá)，從而上調(diào)下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，例如PUMA，Bim，和FasL 等［16］。本研究的Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示BAX 的表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，并且細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved-Caspase3 的表達(dá)水平也是表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

經(jīng)10058-F4 處理后的THP1 細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，結(jié)果顯示處理后出現(xiàn)G2 期細(xì)胞比例隨著藥物濃度逐漸升高，提示10058-F4 可誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞的G2∕M 細(xì)胞周期阻滯，并可能具有DNA 損傷誘導(dǎo)作用。也有研究［17］表明，下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞cMyc 的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖，并通過cMyc∕p21∕CDC2 信 號(hào) 途 徑 誘 導(dǎo)G2∕M 細(xì) 胞 周 期阻滯，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。還有研究顯示CircECE1 與cMyc 相互作用以抑制E3 泛素連接酶斑點(diǎn)型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白（speckle-type POZ）介導(dǎo)的cMyc 泛素化和降解，從而抑制硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（TXNIP）轉(zhuǎn)錄，并激活Warburg 效應(yīng)，參與糖代謝調(diào)節(jié)［18］。本研究通過Western blot 實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)10058-F4 處理可以上調(diào)ATM 和H2AX 蛋白磷酸化水平，提示10058-F4 可誘導(dǎo)DNA 損傷和相關(guān)蛋白的活化。有研究［19］指出，cMyc 過表達(dá)將促進(jìn)S 期時(shí)象細(xì)胞啟動(dòng)DNA 復(fù)制過程，并加劇DNA 基因組的不穩(wěn)定性，促進(jìn)H2AX 的磷酸化水平，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Myc 可以通過產(chǎn)生活性氧簇以及異常的DNA 復(fù)制誘導(dǎo)DNA 損傷，聯(lián)合抑制PI3K 相關(guān)的DNA 損傷應(yīng)答激酶和mTORC1 可誘導(dǎo)Myc 驅(qū)動(dòng)的B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡［20］。但是至今未見到關(guān)于10058-F4 誘導(dǎo)DNA 損傷應(yīng)答及作用機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上所述，cMyc 抑制劑F410058 對(duì)單核細(xì)胞白血病THP1 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是通過誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑所介導(dǎo)。同時(shí)，cMyc 抑制劑F410058 還具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用，也是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。cMyc 抑制劑F410058 的抗白血病作用機(jī)制的研究為AML 的臨床治療提供理論基礎(chǔ)，可能成為AML 患者潛在的治療選擇。