王青玲 張夢嫻 周潁東 郭向東 康浩然 王慶林

1河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（鄭州450046）；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科（鄭州450000）；3河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校護(hù)理系（鄭州451191）

老年性聾是由機(jī)體老化引起的雙耳對稱性、進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾，聽力損失從高頻開始，逐步向中、低頻發(fā)展［1］。我國第二次殘疾人抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)老年性聾的人數(shù)高達(dá)949 萬，且患病率逐年攀升［2］。目前，老年性聾的治療手段主要包括人工耳蝸植入、佩戴助聽器和藥物治療等［3］，但人工耳蝸植入和佩戴助聽器成本過高，而現(xiàn)有的治療藥物臨床療效欠佳［4-5］，因此，從老年性聾的發(fā)病機(jī)制入手、尋求有效治療的藥物是目前臨床上亟需解決的關(guān)鍵問題之一。老年性聾的發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙引起的內(nèi)耳毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變性有關(guān)［6-7］。核因子紅系相關(guān)因子2（Nrf2）是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2 移位到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)下游血紅素加氧酶1（HO-1）等抗氧化因子表達(dá)，進(jìn)而降低耳蝸中氧自由基（ROS）水平，從而保護(hù)內(nèi)耳細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［8］。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是從銀杏干燥的葉中提取的有效成分，含有銀杏黃酮、槲皮素、銀杏內(nèi)酯、有機(jī)酸等多種抗氧化成分［9］，其可通過降低ROS 累積，提高線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ的活性和氧化磷酸化水平，進(jìn)而對多種內(nèi)耳疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮保護(hù)作用［10-11］，但有關(guān)GBE 治療老年性聾機(jī)制方面的研究相對較少，為此，本研究采用D-半乳糖制備老年性聾模型，應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法探討GBE 能否通過調(diào)節(jié)Nrf2∕HO-1 信號通路對老化耳蝸發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 從河南華興動物養(yǎng)殖中心購買4 周、體質(zhì)量150 ～250 g、聽閾正常的雄性SD 大鼠45 只，于SPF 級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在（24 ± 3）℃，自由飲食和攝水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（豫）2020-0002。

1.2 試劑 GBE（北京華潤有限公司，Z11021350）；D-半乳糖（上海麥克林有限公司，C11484411）；TSOD和MDA（江蘇寶萊有限公司，MM-0731R1、MM-0385R1）；2.5%戊二醛（北京索萊寶公司，SP0041）；Nrf2、HO-1 抗體（美國genetex 公司，GTX103322、GTX30748）；Myosin-Ⅶa 抗體（美國Protrus BioSciences 公司，25-6790）；Alexa Flour 488 抗體（美國Jackson 公司，111-545-003）；內(nèi)參GAPDH 抗體（上海UBIYOBIBIO，UBI6010）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備和給藥方法 將SD 大鼠依次編為1-45 號，按照隨機(jī)數(shù)字表分為對照組、模型組和GBE 低、中、高劑量組，每組9 只。模型組和GBE各組大鼠均在頸背部皮下注射D-半乳糖，劑量500 mg∕（kg·d），對照組在頸背部皮下注射等量生理鹽水，共8 周［12］。造模成功后，GBE 低、中、高劑量組分別腹腔注射GBE［10、20、30 mg∕（kg·d）］，對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)8 周。

1.3.2 聽性腦干誘發(fā)電位（ABR） 10%的水合氯醛麻醉大鼠，記錄電極置于大鼠的顱頂中點(diǎn)，參考電極置于檢測耳耳后，揚(yáng)聲器置于距受刺激側(cè)耳廓10 cm 的位置，地線接對側(cè)耳耳后。TDT RZ6∕BioSigRZ 系統(tǒng)收集ABR，采用click 為刺激音，聲刺激從90 dB 開始，10 dB 遞減，接近閾值時(shí)5 dB 遞減，直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激強(qiáng)度確定反應(yīng)閾值。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 選取治療前、后各組大鼠血清在冰上解凍，離心后取上清，按照相應(yīng)試劑盒中提供的制造商說明測定T-SOD 和MDA 的含量。用黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD，用硫代巴比妥酸法測定MDA。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 麻醉后，斷頭處死，用2.5%戊二醛（pH 7.4）在4 ℃灌注固定24 h，脫鈣液脫鈣3 周，用顯微器械取下基底膜，1%的鋨酸4 ℃固定2 h，PBS 漂洗3 次，梯度乙醇，丙酮脫水，將組織包埋在環(huán)氧樹脂中，進(jìn)行超薄切片，切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色（20 min），染色后，水洗，烘干，使用日本透射電子顯微鏡（JEM-1400）拍照。

1.3.5 免疫熒光染色基底膜鋪片 耳蝸用4%多聚甲醛（PFA）固定過夜，脫鈣3 周，在解剖顯微鏡下將基底膜分離為頂回、中回、底回三段，10%山羊血清封閉通透，4 ℃過夜。Myosin-Ⅶa（1∶500）孵育過夜。PBS 漂洗3 次∕10 min。二抗Alexa Flour 488（1∶500）避光孵育2 h。PBS 漂洗3 次∕10 min，DAPI（1∶800）室溫孵育15 min，抗猝滅甘油封片，在熒光顯微鏡下從耳蝸頂回至底回開始逐個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)目，并觀察毛細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6 免疫組織化學(xué) 石蠟切片在60 ℃烘干1 h，二甲苯脫蠟，然后梯度乙醇脫水；使用檸檬酸鈉緩沖液在180 ℃下反應(yīng)90 s；室溫冷卻后，用3%H2O2溶液封閉30 min；1XPBS 漂洗3 次∕5 min；10%山羊血清封閉30 min；Nrf2 與HO-1 抗體分別用抗體稀釋液按照1∶100 比例稀釋，在4 ℃下過夜；1XPBS漂洗3 次∕5 min，Bio-羊抗兔IgG 按照1∶100 比例配置工作液，4 ℃孵育1 h；鏈霉素親和素-POD 工作液4 ℃孵育1 h；滴加DAB 顯色液在顯微鏡下顯色，待組織顏色變?yōu)樽睾稚?，用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況并拍照。

1.3.7 蛋白印跡法 稱取20 μg 耳蝸組織、剪碎、搗碎、冰上裂解10 min；根據(jù)BCA 試劑盒測最終蛋白上樣體積。然后制備SDS-PAGE 凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、1XTBST 洗膜3 次∕5 min、5%脫脂奶粉封閉1 h、洗膜；配制目的蛋白抗體：Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），在4 ℃過夜，利用HRP 標(biāo)記的二抗在室溫孵育2 h；用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯影，Image Lab 成像系統(tǒng)對形成蛋白條帶的斑點(diǎn)進(jìn)行定量，采用GAPDH 作為內(nèi)參對照，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和Dunnett 多重比較檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次以上，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR 閾值 治療前，其余各組與對照組相比ABR 閾值均顯著提高（P＜0.01），表明造模成功；治療后，GBE 低劑量組與模型組比較ABR 閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組ABR 閾值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 銀杏葉提取物治療前后各組大鼠ABR 閾值變化Fig.1 Changes of ABR threshold in rats before and after Ginkgo biloba extract treatment

2.2 血清中T-SOD 和MDA 的含量 治療前，與對照組比較，其余各組血清T-SOD 含量顯著降低（P＜0.01），而MDA 含量明顯升高（P＜0.01）；治療后，與模型組比較，GBE 各組T-SOD 含量逐漸提高，MDA 含量顯著下調(diào)（P＜0.05），尤以中、高劑量組較明顯（P＜0.01），見表1。

表1 治療前后各組血清中T-SOD 和MDA 含量變化Tab.1 Changes of T-SOD and MDA in serum before and after treatment ±s

表1 治療前后各組血清中T-SOD 和MDA 含量變化Tab.1 Changes of T-SOD and MDA in serum before and after treatment ±s

注：治療前，與對照組比較，**P ＜0.01；治療后，與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別對照組模型組銀杏葉提取物低劑量組銀杏葉提取物中劑量組銀杏葉提取物高劑量組T-SOD 含量（pg∕mL）治療前440.09±36.40 295.78±28.16**300.64±14.26**283.04±27.35**306.42±36.40**治療后441.03±39.36 298.89±29.36**326.84±38.12#382.37±20.36##408.65±35.14##MDA 含量（nmol∕mL）治療前5.60±0.44 11.33±0.42**10.06±0.23**11.42±0.50**10.96±0.54**治療后5.67±0.35 10.92±0.53**8.95±0.42#6.93±0.35##6.18±0.55##

2.3 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，線粒體外膜和嵴清晰，髓鞘板層結(jié)構(gòu)緊密，板層呈同心圓排列，邊緣光滑；模型組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象，線粒體數(shù)量減少，密度降低，大量線粒體空泡樣變、雙層膜破裂、嵴模糊不清，螺旋神節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)溶酶體聚集，髓鞘板層排列疏松、紊亂，甚至出現(xiàn)“脫髓鞘現(xiàn)象”。經(jīng)不同劑量GBE 治療后，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈現(xiàn)劑量依賴性改善，胞漿內(nèi)空泡化的線粒體數(shù)量逐漸降低，線粒體外膜和嵴形態(tài)逐漸恢復(fù)，髓鞘板層排列規(guī)整緊密。見圖2。

圖2 各組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Ultrastructural changes of cochlear spiral ganglion cells in each group

2.4 基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量 對照組內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)清晰，呈圓形或矩形，排列整齊，未見明顯病理損傷；模型組中，頂回內(nèi)、外毛細(xì)胞基本正常，中回內(nèi)、外毛細(xì)胞丟失不明顯，僅出現(xiàn)外毛細(xì)胞形態(tài)大小不一，底回內(nèi)、外毛細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)極其不規(guī)整，內(nèi)、外毛細(xì)胞均出現(xiàn)大量丟失，外毛細(xì)胞丟失更嚴(yán)重（P＜0.05）；與模型組相比，GBE 各組內(nèi)、外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸清晰，形態(tài)逐漸改善，底回內(nèi)、外毛細(xì)胞丟失數(shù)量明顯降低，高劑量組改善較明顯（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 免疫熒光染色觀察基底膜頂、中、底回毛細(xì)胞損傷情況（×400）Fig.3 Observation of hair cells damage in Apical turn，Middle turn，Basal turn of basement membrane by immunofluorescence staining（×400）

表2 基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞的數(shù)量Tab.2 Number of inner and outer hair cells in basement membrane ±s

表2 基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞的數(shù)量Tab.2 Number of inner and outer hair cells in basement membrane ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別對照組模型組銀杏葉提取物低劑量組銀杏葉提取物中劑量組銀杏葉提取物高劑量組內(nèi)毛細(xì)胞頂回21.20±1.36 20.93±1.76 20.96±1.21 21.15±0.89 21.18±1.60中回20.32±0.96 19.94±1.26 19.99±0.96 20.26±0.53 20.29±1.92底回22.08±1.72 12.09±0.85*13.68±1.12#14.07±1.76#19.85±1.94##外毛細(xì)胞頂回74.30±4.73 71.58±6.25 71.96±5.97 72.87±7.03 72.98±2.96中回72.18±5.39 68.84±3.85 69.92±4.86 71.62±6.02 72.05±2.85底回78.18±3.82 48.09±8.89**54.96±6.32#59.03±5.80#73.26±6.37##

2.5 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Nrf2和HO-1的表達(dá) Nrf2、HO-1 蛋白在對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞漿中呈棕褐色表達(dá)。與對照組相比，模型組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，GBE 各組Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并表現(xiàn)為劑量依賴性。見圖4。

圖4 各組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)情況（×200）Fig.4 The expression of Nrf2 and HO-1 protein in spiral ganglion cells in each group（×200）

2.6 耳蝸組織中Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá) 與對照組相比，模型組Nrf2、HO-1 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），與模型組對比，GBE 各組Nrf2、HO-1的表達(dá)水平劑量依賴性上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠耳蝸中組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的情況Fig.5 Expression of Nrf2 and HO-1 protein in cochlea of rats in each group

3 討論

老年性聾是由環(huán)境、衰老、遺傳等多種因素共同作用的結(jié)果，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在耳蝸細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮了重要作用［13］。隨著年齡的增長，耳蝸線粒體中內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)（T-SOD和谷胱甘肽）的活性降低，導(dǎo)致ROS和MDA過表達(dá)，進(jìn)而損害線粒體DNA、雙層膜和呼吸鏈等成分，造成毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的氧化損傷［14］。Nrf2可維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)控線粒體膜電位和氧化磷酸化水平，并促進(jìn)ATP 合成，進(jìn)而抑制內(nèi)耳細(xì)胞氧化損傷［15］。HO-1 是Nrf2 的下游產(chǎn)物，Nrf2 移位到細(xì)胞核，促進(jìn)HO-1 轉(zhuǎn)錄，從而降低細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA 水平，保護(hù)細(xì)胞活力［16-17］。LI 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 和HO-1 蛋白在衰老大鼠聽皮層中的表達(dá)明顯下調(diào)，聽功能顯著減退，其原因可能是衰老阻斷了Nrf2 的表達(dá)，抑制HO-1 轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使抗氧化防御系統(tǒng)減弱，線粒體氧化損傷增強(qiáng)，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙和ROS 過表達(dá)。由此可見，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)對延緩老年性聾至關(guān)重要。GBE 可通過清除ROS、提高線粒體功能對耳聾、心腦血管等疾病發(fā)揮保護(hù)作用［19］。CHEN 等［20］研究表明，GBE 可激活Nrf2∕HO-1 通路，抑制線粒體氧化損傷及凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。然而，既往GBE 防治老年性聾的研究大多集中于臨床觀察，未曾對機(jī)制進(jìn)行深入探討，鑒于此，本研究通過構(gòu)建老年性聾模型，來研究GBE 是否能通過Nrf2∕HO-1 信號通路減輕氧化應(yīng)激對老年性聾發(fā)揮保護(hù)作用。

既往研究采用GBE 聯(lián)合巴曲酶治療老年性聾患者，治療后老年性聾患者的純音聽閾閾值明顯降低，血清中T-SOD 水平顯著提高，NO 水平明顯降低，耳蝸細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷減輕，聽功能改善［21］。本研究與既往研究具有相似性，本研究的結(jié)果顯示，模型組大鼠ABR 閾值明顯升高，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯受損，內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)紊亂，數(shù)量大量丟失，血清中T-SOD 含量降低、MDA含量升高，Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。而經(jīng)不同劑量GBE 治療后，ABR 閾值顯著降低，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改善，內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)清晰，數(shù)量呈劑量依賴性增多，血清中T-SOD 含量升高，MDA 含量降低，Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)。

本研究應(yīng)用耳蝸基底膜鋪片，Myosin-Ⅶa 標(biāo)記觀察毛細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化，透射電鏡觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，并用免疫組化與免疫印跡法同時(shí)檢測出GBE 對各組大鼠Nrf2∕HO-1 信號通路影響，具有一定的創(chuàng)新性。雖然本研究對GBE治療老年性聾進(jìn)行了深入探討，但導(dǎo)致老年性聾的病因和發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜，而本研究僅進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，也未對相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行驗(yàn)證，今后還需要從全方位、多層次、多角度結(jié)合更加科學(xué)、前沿的技術(shù)來闡明GBE 防護(hù)老年性聾的機(jī)制，為臨床上探索老年性聾的靶向治療藥物提供幫助與依據(jù)。

綜上所述，GBE 可延緩老年性聾的進(jìn)展，其機(jī)制可能是通過Nrf2∕HO-1 信號通路提高了線粒體的功能，減輕了氧化應(yīng)激對耳蝸細(xì)胞的損傷。