祝曉娟 龍永珍 陳曉玲 張瑩 彭青 周樹勤，4

1喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院麻醉科（新疆喀什844000）；2南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院再生醫(yī)學研究所（廣州510280）；3廣州市紅十字會醫(yī)院兒科（廣州510220）；4南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院麻醉科（廣州510280）

大腸桿菌是引發(fā)臨床感染最為常見的致病菌之一［1］。運動性是大腸桿菌致病力或侵襲力的表型之一，大腸桿菌運動性對細菌向宿主細胞移動很重要［2-3］。運動性與大腸桿菌的遷移、擴散、定植及免疫逃逸均有關［4-5］。有研究表明運動性強的大腸桿菌在自發(fā)性細菌性腹膜炎中比其他菌株致病力更強［6］。

細菌的運動方式主要包括叢動（swarming）、游動（swimming）及蹭行（twiching）［7］。游動是指水環(huán)境下細菌細胞的個體無規(guī)則游動，是鞭毛介導的直線游動和翻騰運動交替進行的運動形式［7］。叢動是在半固體培養(yǎng)基表面細菌群體由接種點向周圍擴散的運動。叢動和游動這兩種運動都有鞭毛介導；但它們的區(qū)別在于：（1）叢動是細菌群體性運動，而游動是細胞個體行為；（2）叢動的細胞會在代謝、形態(tài)及某些蛋白表達等方面發(fā)生顯著分化，即表面誘導分化現(xiàn)象，如鞭毛密度增加、菌體增長，毒力蛋白分泌增加等特性變化［8-9］。蹭行是指某些細菌依靠Ⅳ型菌毛驅動的顫抖現(xiàn)象［10］。

筆者前期研 究 發(fā) 現(xiàn)：1∕2～1∕8 最低抑菌 濃 度（MIC）的氨基糖苷類藥物慶大霉素預處理大腸桿菌ATCC25922 1 h 后，大腸桿菌的叢動性顯著降低。轉錄組測序結果顯示，參與三羧酸循環(huán)（TCA）的8 個基因表達均下調［11］。由于TCA 循環(huán)提供細菌生命活動所需的能量（ATP），細菌叢動性受細菌能量供應的調控［9，12］。慶大霉素抑制叢動與ATP 產(chǎn)生減少、細菌運動所需能量不足的關系尚未明確。本研究將首先驗證亞抑制濃度慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用，以及慶大霉素對TCA 相關基因的表達水平的影響，測定ATP 水平，進而觀察補充ATP 后是否能夠逆轉慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用。本研究在一定程度上闡明了亞抑制濃度的慶大霉素抑制大腸桿菌叢動性的分子作用機制，可為慶大霉素在臨床治療大腸桿菌相關感染提供更多的理論基礎及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑 大腸桿菌ATCC25922，MH肉湯（Muller-Hinton Broth，上海勵瑞生物科技有限公司）；MH 瓊脂（上海勵瑞生物科技有限公司）；慶大霉素（上海生物工程有限公司）；牛肉粉、瓊脂、胰蛋白胨、酵母粉購自英國OXOID 公司，葡萄糖、氯化鈉、腺苷-5-三磷酸二鈉鹽（ATP）購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 慶大霉素預處理對大腸桿菌叢動性的抑制作用 配制叢動瓊脂培養(yǎng)板，使瓊脂培養(yǎng)基中含胰蛋白胨0.8%，酵母提取物0.4%，氯化鈉0.8%，瓊脂0.5%，葡萄糖0.5%。121 ℃高壓滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右，倒入已滅菌的干燥平板中，冷卻備用。在MH 平板上挑取單克隆大腸桿菌過夜培養(yǎng)，用新鮮MH 肉湯稀釋菌液OD600至0.3，加入慶大霉素至終濃度為1∕2 最低抑菌濃度（MIC），該組細菌作為處理組，不加慶大霉素的菌液作為對照組，置于37 ℃孵育1 h。各取1 mL菌液轉移到2 mL EP 管中，室溫10 000 r∕min 離心3 min，去上清，用MH 肉湯洗滌3 次并重懸，用紫外分光光度儀測定OD600，稀釋菌懸液至OD600為0.2。處理組和對照組稀釋菌懸液各取2 μL 接種于叢動瓊脂平板，在37 ℃下孵育12 h，觀察結果并測量直徑，此實驗重復3 次。

1.2.2 Real-time PCR 測定相關基因的表達水平 參考文獻見表1，設計合成目的基因丙酮酸脫氫酶輔酶編碼基因poxB 和aceE，Ⅱ型檸檬酸合成酶基因gltA，琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhD 和sdhC，蘋果酸輔酶A 連接酶beta 亞基編碼基因sucC，延胡索酸水合酶Ⅰ級編碼基因fumA，異檸檬酸脫氫酶編碼基因icd 及管家基因GAPDH 的引物。取1∕2MIC 的慶大霉素誘導后的菌液1.5 mL，先加2 倍體積的細菌RNA 保護液（RNA Protect Bacteria Reagent，Qiagen）混勻，室溫靜置5 min 后，離心，去上清，獲得菌體沉淀。按RNeasy Mini Kit 說明書提取細菌RNA，Nanodrop 測定RNA 濃度。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A，Takara）進行逆轉錄，獲得cDNA 模板，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（RR820A，Takara），EcoTMRealTime PCR system 進行real-time PCR，反應條件為：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。實驗重復3 次，采用ΔΔCt 相對定量法分析目的基因在慶大霉素處理組及對照組的表達變化情況。

表1 Real-time PCR 的引物序列Tab.1 Primer sequence of Real-time PCR

1.2.3 細菌胞內ATP 水平測定 采用ATP 檢測試劑盒ATP Detection Assay Kit-luminescence（Cayman chemical）測定慶大霉素對細菌ATP 產(chǎn)生的影響，過夜培養(yǎng)的細菌用新鮮MH 肉湯稀釋菌液OD600至0.5，加入慶大霉素至終濃度為1∕2 MIC 濃度，設置為處理組，不加慶大霉素的菌液作為對照組，37 ℃孵育1 h 后，將菌液取出，離心，冰浴條件下超聲破碎細菌3 min，每次超聲3 s 間隔3 s；12 000×g離心15 min，取上清放4 ℃?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明書配置制定標準曲線，酶標儀讀取慶大霉素處理組及對照組細菌裂解液的發(fā)光值，根據(jù)標準曲線計算各樣本中的ATP 濃度，每組樣本測試3 次。

1.2.4 補充ATP 對慶大霉素預處理大腸桿菌叢動性的逆轉作用 配置叢動瓊脂培養(yǎng)板，瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右，分別加入腺苷-5-三磷酸二鈉鹽（ATP）使其終濃度為0.9、2.7、4.5 mmol∕L，混勻后倒入已滅菌的干燥平板中，冷卻備用。大腸桿菌過夜培養(yǎng)菌液稀釋后，分別設置慶大霉素預處理和對照組，處理方法同前。處理結束后，各取1 mL 菌液轉移到2 mL EP管中，室溫10 000 r∕min離心3 min，去上清，用MH 肉湯洗滌3 次并重懸，用紫外分光光度儀測定OD600，稀釋菌懸液至OD600為0.2。處理組和對照組稀釋菌懸液各取2 μL 接種于叢動瓊脂平板，在37 ℃下孵育12 h，觀察結果并測量直徑，實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法 各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用Graphpad Prism 5 軟件，t檢驗法進行組間差異比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用 大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)亞抑制濃度慶大霉素預處理后，細菌的叢動性明顯減弱，細菌運動直徑為（25±2）mm，較對照組運動直徑（18.00 ± 2.00）mm 明顯減少（圖1）。該結果證實亞抑制濃度的慶大霉素可抑制大腸桿菌的叢動能力。

圖1 亞抑制濃度慶大霉素對細菌叢動性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of subconcentration gentamicin on bacterial motility

2.2 亞抑制濃度慶大霉素下調大腸桿菌TCA相關基因表達 Real-time PCR 結果顯示，與對照組比較，經(jīng)亞抑制濃度慶大霉素處理后，處理組大腸桿菌ATCC25922 的TCA 相關基因，poxB、aceE、gltA、sdhD、sdhC、sucC、fumA 及icd 基因表達均有不同程度的下調，下調倍數(shù)在0.35 ～0.60之間（圖2）。

圖2 Real-time PCR 檢測大腸桿菌ATCC25922 的TCA 相關基因表達水平Fig.2 Real time PCR was used to detect the expression level of TCA related genes in Escherichia coli ATCC25922

2.3 亞抑制濃度的慶大霉素抑制細菌ATP 的產(chǎn)生 結果顯示，對照組細菌胞內ATP濃度為（24.2±3.45）fm，而1∕2MIC 慶大霉素處理的細菌胞內ATP水平下降至（11.5 ± 1.98）fm，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示亞抑制濃度慶大霉素對大腸桿菌ATP 合成具有抑制作用。

2.4 補充ATP 可逆轉慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用 在培養(yǎng)板添加0.9、2.7、4.5 mmol∕L ATP后，細菌被慶大霉素抑制的叢動能力可被顯著逆轉，細菌在所有添加ATP 的平板中，叢動能力均較對照組和預處理慶大霉素抑制組顯著增強（圖3）。但對比不同組間的運動直徑，結果顯示，在被慶大霉素預處理后，大腸桿菌在含0.9、2.7 mmol∕L ATP平板中的叢動能力無差異，而隨著ATP 濃度增加至4.5 mmol∕L，細菌叢動性并沒有繼續(xù)增強，反而有所下降，提示胞外環(huán)境中過量的ATP 有可能會抑制大腸桿菌的叢動性。見表2。

圖3 補充ATP 逆轉慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用Fig.3 ATP supplementation reverses the inhibitory effect of gentamicin on the plexus of Escherichia coli

表2 不同處理組的細菌運動直徑測量結果Tab.2 Measurement results of bacterial movement diameter in different treatment groups ±s

表2 不同處理組的細菌運動直徑測量結果Tab.2 Measurement results of bacterial movement diameter in different treatment groups ±s

組別對照組（未經(jīng)處理）慶大霉素預處理+不含APT 平板慶大霉素預處理+0.9 mmol∕L ATP 平板慶大霉素預處理+2.7 mmol∕L ATP 平板慶大霉素預處理+4.5 mmol∕L ATP 平板細菌運動直徑（mm）23.00±1.00 15.00±2.00 47.00±2.00 47.67±2.51 37.67±1.53

3 討論

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素［15］。慶大霉素雖然有其毒副作用，但作為對革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌效果較好的抗生素之一，且具有較好的抗生素后效應（PAE），因此臨床應用仍然較廣［16-17］。

本研究結果顯示，經(jīng)不同亞抑制濃度（1∕8 ～1∕2 MIC）慶大霉素預處理1 h 后，撤去慶大霉素后，大腸桿菌的叢動性仍然受到一定的抑制，且抑制作用隨著慶大霉素預處理濃度增加而增加，這一效應也應屬于慶大霉素的PAE 效應的一種，這種特殊的PAE 作用對于臨床治療大腸桿菌感染具有其自身優(yōu)勢。Real-time PCR 進一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1∕2 MIC 慶大霉素處理后，大腸桿菌ATCC 25923 的TCA 相關基因，包括丙酮酸脫氫酶輔酶編碼基因poxB 和aceE、Ⅱ型檸檬酸合成酶基因gltA、琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhD 和sdhC、蘋果酸輔酶A連接酶beta 亞基編碼基因sucC、延胡索酸水合酶Ⅰ級編碼基因fumA 以及異檸檬酸脫氫酶編碼基因icd 均下調。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhA、sdhB 及sdhC 突變株的叢動性較野生株明顯降低，但其更深入的分子機制仍不清楚［18］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，細菌經(jīng)亞抑制濃度的慶大霉素處理后，ATP 產(chǎn)生明顯降低。細菌叢動性是一種群體性的運動，該行為需要細菌能量的供應［19］，有研究發(fā)現(xiàn)，從基因表達譜的特點來看，細菌發(fā)生叢動時存在異質性，位于細菌叢動中心的細菌更像提供營養(yǎng)的菌群，而位于邊緣位置的細胞更傾向于表達參與能量代謝的基因，包括電子傳遞鏈的成分和ATP 的產(chǎn)生［20-21］。說明細菌叢動性的運動方式跟能量代謝息息相關。據(jù)此，結合本研究結果，亞抑制濃度的慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用，可能與其抑制TCA 和進一步抑制ATP 產(chǎn)生有關。

研究表明，在培養(yǎng)環(huán)境中補充ATP，細菌是可以將胞外的ATP 攝入到細菌內部并進行充分利用的［13］。為了進一步驗證ATP 產(chǎn)生減少是否是導致大腸桿菌叢動性降低的原因，在叢動培養(yǎng)基中添加了不同濃度的ATP，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慶大霉素預處理后，再接種于含不同濃度ATP叢動培養(yǎng)基的大腸桿菌，其叢動性均較對照組和慶大霉素預處理組的叢動性明顯增強，提示亞抑制濃度慶大霉素是通過抑制ATP 的產(chǎn)生調控大腸桿菌的叢動能力。但不同ATP 濃度組間存在結果差異，大腸桿菌在含0.9、2.7 mol∕L ATP 平板中的運動直徑相似，而隨著ATP 濃度增加至4.5 mol∕L，細菌叢動性并沒有繼續(xù)增強，反而較前兩組有所下降，提示胞外環(huán)境中過量的ATP反而會抑制大腸桿菌的叢動性。

本研究探討了亞抑制濃度的慶大霉素對大腸桿菌叢動性的抑制作用相關機制，結果發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度的慶大霉素可能通過抑制TCA 相關基因的表達，限制了細菌ATP 的產(chǎn)生，從而導致細菌叢動性下降。該研究結果為進一步揭示慶大霉素的PAE 發(fā)生機制提供了新的理論依據(jù)。