李嘉鈴 周小婷 董柏青，2 陳欽艷 胡莉萍 王超 蘇永健 李海，2

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院流行病學(xué)教研室（南寧 530200）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧 530200）；3廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心廣西病毒性肝炎防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧 530029）；4廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（南寧 530200）

持續(xù)的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染若不加以干預(yù)，將逐漸發(fā)展成肝纖維化或肝硬化，甚至最終導(dǎo)致肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)［1］，接種乙肝疫苗（HepB）是預(yù)防HBV感染的最安全有效的措施。近三十年來，隨著我國將兒童HepB 接種納入了免疫規(guī)劃，新生兒出生時(shí)接種HepB 的覆蓋率較高，HBV 感染發(fā)生率呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，現(xiàn)階段人群HBV 感染率為5%～6%，5 歲以下兒童控制在0.2%左右［2］。但仍有5%～10%人群（包括部分嬰幼兒和成人）在接種HepB 后，抗?HBs 濃度<100 mUI/mL 甚至無 抗體產(chǎn)生，處于低/無應(yīng)答狀態(tài)，從而不能有效抵御HBV 的感染［3］。

影響HepB 免疫應(yīng)答水平因素有很多，其中最主要的是個(gè)體遺傳因素［4］。在表觀遺傳學(xué)研究中，DNA 甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控起著重要作用［5］?；蛭稽c(diǎn)與DNA 甲基化水平有關(guān)［6］。FTO基因?qū)儆趍6A 去甲基化酶，參與m6A 調(diào)控。研究表明FTO 基因發(fā)生DNA 甲基化可引起肥胖、糖尿病、肝炎和腫瘤等一系列疾?。?-8］，其中大多與肝病有關(guān)。宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平是否會(huì)導(dǎo)致該酶的表達(dá)產(chǎn)生偏離或者錯(cuò)誤，該酶的功能發(fā)生改變，從而影響m6A 修飾，導(dǎo)致免疫分子表達(dá)異常和HepB 免疫低/無應(yīng)答的發(fā)生，目前尚未明確。本研究擬通過分析宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平與乙肝疫苗低/無應(yīng)答水平之間的關(guān)聯(lián)性，為預(yù)測(cè)個(gè)體乙肝疫苗的應(yīng)答水平，研發(fā)新型HepB 疫苗提供科學(xué)的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象研究對(duì)象來源于2014-2016年間至廣西南寧市三所三級(jí)甲等醫(yī)院就診的8～9月齡263 例兒童。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）兒童的父母雙方均為廣西籍漢族人。（2）已按免疫程序接種三針乙肝疫苗。（3）肝功能項(xiàng)目正常者。（4）HBV DNA陰性者。（5）乙肝血清標(biāo)記物檢測(cè)中，除抗?HBs之外，其余四項(xiàng)均為陰性。（6）既往無HBV 感染及其他肝炎病史。（7）未罹患先天或基礎(chǔ)性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：缺少以上納入標(biāo)準(zhǔn)的任意一條或多條。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì)根據(jù)研究對(duì)象的抗?HBs 濃度水平進(jìn)行分組：（1）抗?HBs濃度<10 mIU/mL為無應(yīng)答組；（2）10 mIU/mL≤抗?HBs濃度<100 mIU/mL為低應(yīng)答組；（3）100 mIU/mL≤抗?HBs濃度<1 000 mIU/mL 為正常應(yīng)答組；（4）抗?HBs 濃度≥1 000 mIU/mL 為高應(yīng)答組。本研究采用非匹配病例對(duì)照研究方法，將無/低應(yīng)答水平（抗?HBs 濃度<100 mIU/mL）作為病例組，正常/高應(yīng)答水平（抗?HBs濃度≥100 mIU/mL）作為對(duì)照組。

1.2.2 血樣采集研究對(duì)象完成乙肝疫苗免疫接種程序后的第8 周，采集其外周靜脈血10 mL，用于檢測(cè)“乙肝兩對(duì)半”、HBV?DNA 及提取DNA 進(jìn)行DNA 甲基化檢測(cè)。

1.2.3 乙肝血清標(biāo)記物檢測(cè)取5 mL 全血分離出血清，采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（Abbott，AX?SYM）定量檢測(cè)“乙肝兩對(duì)半”，套式PCR 法檢測(cè)HBV?DNA 。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)步驟和結(jié)果判斷。

1.2.4 血樣DNA提取及濃度測(cè)定取另外5 mL全血，采用Trizol 法提取DNA。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠圖像成像系統(tǒng)中觀察基因組DNA 的完整性：電泳條帶清晰可見，無明顯降解和RNA 污染；采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因DNA 質(zhì)量：檢測(cè)DNA 濃度≥20 ng/μL，總量≥1 μg，OD260/280=1.7～2.0，OD260/230≥1.8。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)與單位點(diǎn)PCR 條件優(yōu)化采用上海天昊科技公司的專利軟件，針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)和優(yōu)化多重PCR 引物。

1.2.6 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化測(cè)序技術(shù)（BS?Seq）采用EZ DNA 甲基化試劑盒對(duì)DNA 進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，將基因組中未被甲基化修飾的DNA 胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏。以優(yōu)化后的多重PCR 引物為模板對(duì)經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后樣本目標(biāo)片段進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增。

1.2.7 樣本添加特異性標(biāo)簽序列與上機(jī)測(cè)序通過11 個(gè)循環(huán)數(shù)PCR 擴(kuò)增技術(shù)將帶有Index 序列的引物引入文庫末端并添加特異性標(biāo)簽序列。將所有樣品Index PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合后割膠回收，獲得Methyl Target 測(cè)序數(shù)據(jù)庫。確定產(chǎn)物濃度后以2×150 bp 的雙端測(cè)序模式通過Illumina Hiseq平臺(tái)，進(jìn)行高通量測(cè)序并獲得數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，年齡符合正態(tài)分布，兩組間年齡的比較用t檢驗(yàn)。FTO 基因甲基化水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)（M）和四分位距（IQR）進(jìn)行描述。采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)，比較觀察（低/無應(yīng)答）組和對(duì)照（正常/高應(yīng)答）組FTO 基因DNA 甲基化水平的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 倫理審查本研究已通過廣西倫理委員會(huì)的倫理審查（IRB SQ/01.01/02），研究對(duì)象的父母已知曉相關(guān)研究內(nèi)容、目的并簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況本研究共納入263 例8～9月齡的廣西漢族兒童作為研究對(duì)象，其中男童、女童分別為228 名（228/263，86.7%）、35 名（35/263，13.3%）；乙肝疫苗無、低、正常、高應(yīng)答者分別為8 例（8/263，3.0%）、96 例（96/263，36.5%）、68 例（68/263，25.9%）、91 例（91/263，34.6%）；病例組104 例（104/263，39.5%），對(duì)照組159 例（159/263，60.5%）。觀察組和對(duì)照組的性別（χ2=-0.004，P=0.953）和年齡（t=-0.08，P=0.930）構(gòu)成比之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

表1 研究對(duì)象基本情況及抗?HBs 免疫應(yīng)答水平分布Tab.1 Basic information and anti?HBs immune response level distribution of subjects

2.2 病例組和對(duì)照組FTO 基因DNA 甲基化水平比較分析觀察組和對(duì)照組FTO 基因28 個(gè)位點(diǎn)CpG 島DNA 甲基化情況與HepB 免疫應(yīng)答水平的關(guān)系，結(jié)果顯示：FTO 基因各基因位點(diǎn)的DNA 甲基化水平都比較低。觀察組和對(duì)照組的DNA 甲基化水平 在FTO_1 基因222 位點(diǎn)、FTO_2 基因72 位 點(diǎn)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組FTO_1 基因222位點(diǎn)的DNA 甲基化水平高于對(duì)照組（Z=-2.38，P=0.009）。觀察組FTO_2 基因72 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平高于對(duì)照組（Z=-1.71，P=0.044）。見表2。

表2 病例組和對(duì)照組FTO 基因DNA 甲基化水平比較Tab.2 Comparison of FTO gene DNA methylation levels between the case group and the control groupM（P25，P75）

2.3 病例組與對(duì)照組FTO_1基因222位點(diǎn)、FTO_2基因72 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平差異情況檢測(cè)研究對(duì)象外周靜脈血FTO_1 基因的222 位點(diǎn)和FTO_2 基因的72 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平，以CpG位點(diǎn)為單位，通過boxplop 散點(diǎn)圖表示觀察組和對(duì)照組DNA 甲基化水平情況。見圖1-2。

圖1 觀察組與對(duì)照組FTO_1 基因222 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平差異情況Fig.1 Differences in DNA methylation levels of FTO_1 gene locus 222 between the case group and the control group

3 討論

DNA 甲基化可通過改變基因的結(jié)構(gòu)［9］、干擾轉(zhuǎn)錄因子［10］、改變?nèi)旧w的形態(tài)［11］等影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而影響著人體的生理、病理活動(dòng)。在許多疾病中，比如腫瘤，抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)通常發(fā)生了大量的?CH3修飾，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)障礙。在HBV感染的肝癌患者中腫瘤啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生?CH3修飾水平明顯高于慢性肝炎的患者［12］。可見，宿主基因DNA 甲基化在腫瘤、慢性肝炎等疾病中發(fā)揮著重要的作用，但未見DNA 甲基化與乙肝疫苗低/無應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道。

圖2 觀察組與對(duì)照組FTO_2 基因72 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平差異情況Fig.2 Differences of DNA methylation levels of FTO_2 gene locus 72 between the case group and the control group

m6A 發(fā)生甲基化，可以影響DNA 完成轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)和mRNA 的構(gòu)型變化、解讀及運(yùn)轉(zhuǎn)。FTO 酶作為m6A 去甲基化酶，在m6A 調(diào)控中是不可缺少的。有研究顯示［13］肝細(xì)胞癌患者m6A甲基化水平均高于健康者；FTO 基因低表達(dá)水平預(yù)示肝癌良好的預(yù)后，降低FTO 表達(dá)后肝細(xì)胞繁殖的增加［14］。FTO 基因的rs9939609A 變異患者中肝炎的患病率更高［15］。FTO 基因rs1421085 的C、rs8050136 的A、rs3751812 的T 和rs9939609 的A 變異均與脂肪性肝?。∕AFLD）風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)［16］?？梢姡現(xiàn)TO 基因的DNA 甲基化水平會(huì)影響肝癌、肝炎、脂肪性肝病等肝類疾病的發(fā)生發(fā)展，但宿主FTO 基因DNA 甲基化水平是否會(huì)影響RNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白表達(dá)，從而影響m6A 修飾，導(dǎo)致免疫分子表達(dá)異常和HepB 免疫低/無應(yīng)答的發(fā)生，目前未見相關(guān)報(bào)道。基于以上觀點(diǎn)，猜測(cè)去甲基化酶FTO 基因發(fā)生DNA 甲基化后，可能會(huì)導(dǎo)致該酶的表達(dá)產(chǎn)生偏離或者錯(cuò)誤，酶的功能發(fā)生改變，影響m6A 修飾調(diào)控作用，從而影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致乙肝疫苗低/無應(yīng)答現(xiàn)象的發(fā)生。

為了驗(yàn)證這一猜測(cè)，本研究采用非匹配病例對(duì)照的研究方法，對(duì)263 例8～9月齡廣西漢族兒童進(jìn)行FTO 基因DNA 甲基化水平測(cè)定，分析其與乙肝疫苗免疫應(yīng)答水平的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示：FTO基因各基因位點(diǎn)的DNA 甲基化水平都比較低；觀察組和對(duì)照組的DNA 甲基化水平在FTO_1 基因222 位點(diǎn)、FTO_2 基因72 位點(diǎn)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；觀察組FTO_1 基因222 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平高于對(duì)照組；觀察組FTO_2 基因72 位點(diǎn)的DNA甲基化水平高于對(duì)照組。這提示人體中FTO 基因存在發(fā)生甲基化的可能，乙肝疫苗接種者免疫低/無應(yīng)答水平可能受FTO_1 基因222 位點(diǎn)、FTO_2 基因72 位點(diǎn)的影響。由此，推測(cè)FTO 基因作為去甲基化酶，通過DNA 甲基化修飾后可能使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和相應(yīng)的功能也隨之發(fā)生改變，導(dǎo)致m6A RNA 甲基化修飾出現(xiàn)異常，影響RNA 的轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定、翻譯、降解等過程，從而影響蛋白質(zhì)的合成，可能使宿主免疫調(diào)節(jié)分子的基因表達(dá)發(fā)生改變，引起HepB 接種者免疫低/無應(yīng)答水平的發(fā)生。

本研究存在一定的局限性和不足之處。第一，研究樣本量較小，研究對(duì)象局限于廣西漢族兒童，研究地區(qū)局限于廣西南寧市三所醫(yī)院；第二，未收集兒童的出生體質(zhì)量、身長、疾病狀況、營養(yǎng)狀況、分娩方式等其他可能的影響因素；第三，未能對(duì)FTO 基因發(fā)生DNA 甲基化的靶基因mRNA 表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，本次研究可能會(huì)存在一定的選擇偏倚和混雜偏倚。在今后研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量和研究對(duì)象范圍，選取多家醫(yī)院或社區(qū)開展研究，開展相關(guān)的動(dòng)物體內(nèi)、體外試驗(yàn)，通過敲除或過表達(dá)去甲基化酶FTO 基因，進(jìn)一步深入探討靶基因mRNA 表達(dá)和乙肝疫苗免疫應(yīng)答水平的關(guān)系，從而預(yù)測(cè)個(gè)體乙肝疫苗免疫應(yīng)答的水平，為研發(fā)新型疫苗提供依據(jù)。