陳晴晴 冼嘉嘉 王燕超 何健淳 何文智 李少英 黎青

廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東省重大疾病重點實驗室（廣州 510150）

地中海貧血（簡稱“地貧”）是最常見的單基因遺傳病之一，世界范圍內(nèi)大約有5%的人群有異常血紅蛋白病，其中2.9%是地貧引起的。每年約有300 000～400 000 例異常血紅蛋白疾病的嬰兒出生［1］。在中國，地貧存在地區(qū)差異性分布，其中以“兩廣”及海南為高發(fā)區(qū)，廣東省α 和β 地貧的人群基因攜帶率分別是8.53 %和2.54 %［2］。由于地貧的疾病特點為小細胞、低色素貧血，因此地貧基因攜帶者或患者常伴有血液學指標的改變。異常血紅蛋白會導致貧血等癥狀，嚴重的貧血會引起胎兒的發(fā)育異常。比如目前已知的巴氏水腫胎、胎兒重度β 地貧等，在臨床上是建議終止妊娠的。所以對于南方地區(qū)，特別是廣東、廣西及海南的人群進行地貧篩查尤為重要。人群篩查的目的主要是確定夫妻雙方生育后代患嚴重地中海貧血的風險［3］。周艷潔等［4］通過觀察對比分析大人群地中海貧血篩查的方法發(fā)現(xiàn)通過紅細胞平均體積篩選出陽性人群做血紅蛋白電泳，再針對電泳結(jié)果做α 地貧基因檢測的方法在人力、經(jīng)濟、干預(yù)地貧胎兒效果上更有優(yōu)勢。

臨床上篩查地貧的常用方法是血液樣本檢驗，地貧相關(guān)的血液檢驗指標包括：血紅蛋白、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、血紅蛋白A2（HbA2）等。MCH 及MCV 是最常用的指標，若MCV 小于80 fL 和/或MCH 小于27 pg 表明篩查結(jié)果陽性［5］，需進行HbA2 檢測判斷患者是否為β?地中海貧血攜帶者［6］。HbA2 值高于3.4%～3.6%被認為是β?地貧攜帶者，可通過DNA 基因分析進行明確診斷［7］。在一些情況下，比如α?地貧合并β?地貧，MCV 可以處于臨界范圍，HbA2 在正常范圍，這可能是因為兩種地貧之間存在相互作用。

地貧的診斷需要結(jié)合血液學表現(xiàn)、血紅蛋白電泳及DNA 基因分析［8］，對于臨床上可疑的血液指標結(jié)果需要進一步行地貧基因診斷。地貧基因診斷方法目前有常規(guī)范圍的地貧基因診斷，包括3種缺失型α?地貧基因突變類型、非缺失型α?地貧基因3 種常見突變類型和β?地貧基因17 種常見突變類型。但是這種常規(guī)的α、β 地中海貧血基因檢測方法僅能覆蓋約95%的地貧基因缺陷，仍有5%左右的其他型別未能覆蓋。所以對于常規(guī)檢測方法檢測不出的基因類型，需進行DNA 測序方法進一步診斷。

隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多未知的地貧基因類型被發(fā)現(xiàn)。血紅蛋白Ube?2（Hb Ube?2）就是被發(fā)現(xiàn)的罕見型別之一。Hb Ube?2 首先由MIYAJI 等［9］在日本發(fā)現(xiàn)，1981年日本IUCHI 等研究者報道了日本第2 例Hb Ube?2（α68［E?17］ASN→ASP），其α 鏈N 端第68 位的門冬酰胺被門冬氨酸所替代（α68Asn→Asp）。Hb Ube?2是廣東省較常見的三種α?珠蛋白變異體之一［10］，國內(nèi)首次報道的Hb Ube?2 是在廣東省湛江發(fā)現(xiàn)的。在對深圳地區(qū)異常血紅蛋白病的調(diào)查研究中，深圳地區(qū)20 734例篩查樣本中發(fā)現(xiàn)1 例Hb Ube?2 復(fù)合CD118 雜合子異常血紅蛋白［11］，可見Hb Ube?2 型異常血紅蛋白類型的罕見。

在現(xiàn)存的文獻中還未發(fā)現(xiàn)有Hb Ube?2 復(fù)合CD37 雜合子異常血紅蛋白的相關(guān)報道。本文先證者的異常血常規(guī)結(jié)果與未檢測出地中海貧血類型相矛盾，患者的血紅蛋白、MCH 及MCV 都低于正常值范圍的下限，為輕度貧血，患者的HbA2（%）顯著升高，這引起了筆者的關(guān)注，并進一步對其家系進行DNA 基因測序，以望找到患者血常規(guī)結(jié)果異常的病因及其分子遺傳特點，并評估后代發(fā)生重度地貧的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取該家系三代成員，先證者、先證者之妻、先證者之父、先證者之母、先證者之子、先證者之弟、先證者之弟媳、先證者之侄女共八個成員。

1.2 常規(guī)方法檢測地貧基因型

1.2.1 儀器及試劑血細胞分析儀（NX?9000，Sys?mex，日本），全自動毛細管電泳儀（Capillarys 2 Flex Piercing，Sebia，法國），離心機（Eppendorf 5240，德國），PCR 擴增儀（ABI9700，美國），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio?rad，美國），水平電泳槽及電泳儀（Bio?rad，美國），恒溫水浴箱。全血基因組DNA 提取試劑盒（QIAGEN，德國），地貧基因檢測試劑盒購于亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，試劑均為廠家原裝配套試劑。

1.2.2 血紅蛋白電泳嚴格按照全自動毛細管電泳儀（Capillarys 2 Flex Piercing）的說明書進行操作，分析樣本各血紅蛋白組分的含量。

1.2.3 基因型分析以DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）提取基因組DNA。采用跨越斷裂點PCR（gap polymerase chain reaction，Gap?PCR）技術(shù)檢測3 種缺失型α?地貧基因突變類型（??SEA、?α3.7 和?α4.2），采用PCR?反向點雜交法（PCR?reverse dot blot，PCR?RDB）技術(shù)檢測非缺失型α?地貧基因3 種常見突變類型（ααWS，ααCS 和ααQS）和β?地貧基因17 種常見突變類型CD41?42、IVS?2?654、?28、CD71?72、CD17、βE、CD31、27/28、IVS1?1、CD43、?32、?29、?30、CD14?15、CAP、Int、IVS1?5），所有地貧基因診斷試劑盒均來源于亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3 DNA 測序地貧基因檢測方法

1.3.1 基因組DNA 提取采用Qiagen 法提取全血基因組DNA，Thermo 公司的NANODROP 2000 紫外分光光度計測定DNA 濃度和純度。

1.3.2 引物設(shè)計共設(shè)計3 對引物，擴增7 種異常Hb，具體引物序列見表1。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增PCR 擴增試劑來自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，總反應(yīng)體積為50 μL。α1、α2 測序擴增反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性45 s，65 ℃退火1 min30 s，72 ℃延伸3 min，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；β 測序擴增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性1 min，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后，取5 μL 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min。

1.3.4 DNA 測序?qū)CR 擴增產(chǎn)物純化后行雙向DNA 測序（Sanger 雙脫氧末端終止法）。測序圖采用Chrome 軟件進行分析，并與Genbank α?珠蛋白基因（NG000006.1）和β?珠蛋白基因（NG000007.3）進行比對。同時與異常血紅蛋白及地貧數(shù)據(jù)庫（http：//globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html）進行比對分析。

1.4 血細胞分析采用血細胞分析儀進行血細胞分析，送檢樣本在4 h 內(nèi)完成檢測。主要觀察指標為血紅蛋白、MCV、MCH。

2 結(jié)果

2.1 地貧基因檢測結(jié)果先證者及其家系成員的地貧基因檢測結(jié)果，見表2。

表2 先證者及其家系成員的地貧檢測結(jié)果Tab.2 Test results of thalassaemia of the proband and his family members

2.2 DNA 測序結(jié)果先證者、先證者之父親的DNA 測序結(jié)果，見圖1。

圖1 先證者、先證者之父親的DNA 測序結(jié)果Fig.1 DNA sequencing results of the proband and his father

2.3 血常規(guī)檢驗結(jié)果先證者及其家系成員血常規(guī)檢驗結(jié)果，具體指標見表3。

表3 先證者及其家系成員血常規(guī)檢驗中血紅蛋白、MCV、MCH、HbA（%）、HbA2（%）、血紅蛋白12 區(qū)（Hb Zone12）的結(jié)果Tab.3 Results of hemoglobin，MCV，MCH，HbA（%），HbA2（%）and Hb Zone12 in routine blood tests of proband and their family members

3 討論

本文先證者的血紅蛋白、MCH 及MCV 低于正常范圍的下限，通過臨床上常規(guī)檢測地貧的方法基因測序，通過對先證者及其家屬的測序結(jié)果分析，進行以下討論。未發(fā)現(xiàn)異常。但是患者HbA2（%）的數(shù)值明顯升高，提示患者很有可能存在beta 地貧基因的異常。通過對患者及其家屬進一步DNA 測序發(fā)現(xiàn)患者為Hb Ube?2 雜合突變復(fù)合CD37 雜合突變，為罕見的異常血紅蛋白類型。筆者對臨床檢驗異常的結(jié)果給予了重視并進一步分析，認為患者存在異常血紅蛋白的可能性很大。而且這種異常血紅蛋白的存在與患者的血常規(guī)檢驗結(jié)果異常是否相關(guān)，其家系遺傳特點及其血液學表現(xiàn)對后代是否產(chǎn)生影響尚不清楚。因此筆者對患者及家屬進行了DNA

在對家系結(jié)果分析的過程中，發(fā)現(xiàn)先證者之弟及先證者之子均為Hb Ube?2雜合突變，兩人均發(fā)育正常，血常規(guī)無明顯異常，MCH 及MCV 在正常范圍內(nèi)。國內(nèi)有少許關(guān)于HB Ube?2 的報道，在廣東省珠海市婦幼保健院的6 297 份樣本中，篩查出2 例Hb Ube?2 異常類型［12］。HUANG 等［13］報道了1 例Hb Ube?2 異常類型，并表示其對患者的臨床表現(xiàn)無明顯影響。根據(jù)目前已報道的HB Ube?2 異常血紅蛋白患者血液學表現(xiàn)，結(jié)合本文先證者之弟及先證者之子的血液學表現(xiàn)，說明單純的Hb Ube?2 雜合突變對患者的血常規(guī)沒有產(chǎn)生明顯影響。

CD37 雜合突變?yōu)閎eta 基因密碼子37 的無義突變，由于β?珠蛋白肽鏈的生物合成完全被抑制，構(gòu)成血紅蛋白的α?珠蛋白肽鏈和β?珠蛋白肽鏈的平衡被破壞，使得正常血紅蛋白合成減少或者無法合成［14］。CD37 突變包括CD37（TGG>TAG）和CD37（TGG>TGA）兩種。在中國人群中相對較常見的是CD37（TGG>TAG），國外偶有CD37（TGG>TGA）的報道。在來自于巴勒斯坦地區(qū)的β 地貧的分析中報道了1 例CD37（TGG>TGA）突變［15］。CD37 雜合突變的發(fā)生率低，在一份對泉州11 668 例地中海貧血病例調(diào)查中發(fā)現(xiàn)CD37 雜合突變的病例只有2 例，占整個調(diào)查病例的0.14%［16］。其臨床表現(xiàn)為β0 地貧，為輕型的β 地貧臨床特征，MCH 及MCV 降低，HbA2（%）的數(shù)值升高，與本文的先證者及其父親的臨床表現(xiàn)一致。秦丹卿等［17］對12 例CD37 突變陽性的病例進行分析發(fā)現(xiàn)其HbA2 均升高。目前還沒有CD37 純合突變的報道。根據(jù)李育敏等［18］報道的一罕見β 地貧基因CD37（TGG→TAG）突變復(fù)合ɑ 地貧家系的檢測結(jié)果提示MCH及MCV 降低，HbA2 升高，與本文的β0 地貧臨床表現(xiàn)同樣符合。

先證者DNA 測序結(jié)果其為Hb Ube?2 雜合突變復(fù)合CD37 雜合突變，通過對比其父母的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其突變來源于其父親。先證者及其父親的MCH及MCV 均低于正常值范圍的下限，為輕度貧血。兩者的HbA2（%）的數(shù)值明顯升高，測序結(jié)果驗證了筆者最初的考慮，兩者均合并了β?地貧類型。目前還未有Hb Ube?2 雜合突變復(fù)合CD37 雜合突變相關(guān)的報道。在研究過程中，還發(fā)現(xiàn)先證者之侄女為Hb Ube?2/SEA 地貧類型，屬于α 地貧的SEA 缺失合并Hb Ube?2 雜合突變類型。目前還未發(fā)現(xiàn)有與此相關(guān)的報道。其血紅蛋白、MCH 及MCV 都低于正常值范圍的下限。對比上文討論的單純的Hb Ube?2 雜合突變對MCH 及MCV 無明顯影響，Hb Ube?2/SEA 地貧類型及Hb Ube?2 復(fù)合CD37 雜合突變對MCH 及MCV 有一定的影響，這與文獻報道的結(jié)果相一致。在一份對江蘇省無錫地區(qū)異常血紅蛋白病的流行病學調(diào)查報道中發(fā)現(xiàn)的1 例Hb Ube?2 雜合突變，其血紅蛋白及MCV 在正常范圍［19］。

Hb Zone 12 區(qū)域是在毛細管電泳中出現(xiàn)的峰，PANYASAI 等［20］在罕見的Hb 沈陽［α26（B7）Ala→Glu，HBA2：c.80C>A（or HBA1）］變異體研究中報道了攜帶此變異體的在毛細管電泳中會出現(xiàn)Hb Zone 12。在RECASENS 等［21］報道的新血紅蛋白變異體中，通過毛細管電泳發(fā)現(xiàn)Hb Zone 12 出現(xiàn)的峰值占整個血紅蛋白的3.3%。在我國也有相關(guān)的報道，胡帥等［22］報道的四川1 例Hb J Bangkok 基因突變中，通過毛細管電泳方法發(fā)現(xiàn)異常的Z12 區(qū)域峰，此會影響蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，但是不會改變血紅蛋白的功能。結(jié)合本文報道的在Hb Zone 12區(qū)域出現(xiàn)的峰可以發(fā)現(xiàn)，在毛細管電泳中出現(xiàn)Zone 12 區(qū)域峰，很有可能存在罕見的異常血紅蛋白，需要進一步驗證其類型，至于存在的異常血紅蛋白是否影響患者的血液系統(tǒng)，還需結(jié)合患者的血液指標進行分析。

本文先證者常規(guī)地貧檢測結(jié)果未有異常與先證者異常的血常規(guī)結(jié)果相矛盾，因此從這點著手對先證者的家系進行了DNA 測序分析。測序結(jié)果解釋了先證者血常規(guī)結(jié)果異常的原因，通過對家系DNA 測序結(jié)果的分析，并進行文獻查找，進一步發(fā)現(xiàn)Hb Ube?2 雜合突變復(fù)合CD37 雜合突變類型對血常規(guī)的影響趨勢與單獨的CD37 雜合突變類型一致。CD37 雜合突變類型對血紅蛋白合成的影響機制與Hb Ube?2 雜合突變復(fù)合CD37 雜合突變類型的影響機制是否一致目前還不清楚，有望在接下來的研究中進一步探究。但是對于臨床上血液檢測有異常改變的患者，還是需通過分子診斷的方式進一步確診，這在產(chǎn)前診斷和婚育指導上有重要意義。