杜美玲 王曉元 張愛愛 郝翠君 張鵬祥

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（河北張家口 075400）

在過去的20年中，房顫已經(jīng)成為最重要的公共衛(wèi)生問題之一，并且是西方國家醫(yī)療保健成本增加的重要原因。中國癡呆患者的數(shù)量約占全球癡呆患者總數(shù)的25%。越來越多的證據(jù)表明，無論房顫患者是否合并腦卒中，房顫與認(rèn)知功能障礙都顯著相關(guān)［1］。在沒有臨床卒中的情況下，房顫患者比無房顫病史的患者更早達(dá)到認(rèn)知障礙或癡呆的閾值［2］，房顫與認(rèn)知功能障礙的高風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)［3］。隨著房顫的流行性和其預(yù)期壽命的增加，這些與房顫相關(guān)的認(rèn)知障礙的患病率預(yù)計(jì)將顯著上升。房顫患者的抗凝治療是房顫治療的重要內(nèi)容，能夠顯著降低栓塞風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)對患者的認(rèn)知功能存在保護(hù)作用［4］。本研究檢測了房顫合并認(rèn)知功能障礙患者外周血神經(jīng)源性外泌體為載體的T?tau 蛋白及Aβ1?42 含量，并分析抗凝治療對此水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年4月至2020年8月在我院心血管內(nèi)科住院且符合入選條件的房顫患者作為研究對象，按照是否進(jìn)行抗凝治療分為兩組，其中抗凝治療組包括40 名患者，未進(jìn)行抗凝治療組100 名患者。基于簡易精神狀態(tài)做檢查（MMSE）評分的癡呆癥納入標(biāo)準(zhǔn)因文化程度不同而異：文盲<17分，小學(xué)<20分，初中及以上<24 分，同時(shí)，臨床癡呆評分（clinical dementia rating，CDR）≥1和缺血指數(shù)（Hachinski?lnchemic 評分，HIS）≤4；基于MMSE 評分的輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）納入標(biāo)準(zhǔn)：文盲>17分，小學(xué)>20分，初中及以上>24分，同時(shí)CDR ≤0.5 和HIS ≤4。對所有患者進(jìn)行認(rèn)知功能評分，包括96 名認(rèn)知功能障礙（cognitive im?pairment，CI）患者（其中45 名癡呆患者，51 名輕度認(rèn)知功能障礙患者）和44 名認(rèn)知功能正?；颊撸╟ognitive normal，CN）。表1列出了研究人群的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征。依據(jù)房顫患者是否抗凝治療進(jìn)行分組，兩組患者的年齡、女性比例、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其教育水平均存在顯著性差異（P<0.01）。所有知情同意書均已由參與者或其法定監(jiān)護(hù)人簽署。本研究由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理審查委員會審查和批準(zhǔn)（倫理批號：K2017179）。

表1 患者臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients例（%）

1.2 收集外周血神經(jīng)源性外泌體禁食12 h 后早晨采集5 mL 全血于EDTA 抗凝管中，3 000×g離心15 min，分離的血漿收集在2 mL 無菌管中，獲得用于提取外泌體的血漿，儲存在-80 ℃冰箱中；血漿樣品在4 ℃下解凍，3 000×g4 ℃離心10 min，繼以10 000×g4 ℃下離心20 min 以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)；0.5 mL 上清液用在4 ℃下預(yù)冷的2 mL 1×磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，HyClone）稀釋，添加0.5 mL 血液純化液（BPS，Umibio）試劑；在4 ℃下培養(yǎng)2 h 后，將混合溶液在10 000×g4 ℃下離心60 min 以獲得沉淀外泌體顆粒；將外泌體重新懸浮在200 μL PBS 中，然后將懸浮混合物在12 000×g4 ℃下離心2 min。保留富含外泌體的上清；在3 000×g4 ℃下離心10 min 的外泌體純化過濾器進(jìn)行純化。將每個樣品與1 μg小鼠抗人L1細(xì)胞黏附分子（L1CAM）單克隆生物素化抗體（Thermo Fisher Scientific）和50 μL 3%牛血清白蛋白（BSA，Sigma）混合，4 ℃下培養(yǎng)60 min；添加25 μL 鏈霉親和素瓊脂糖樹脂（Thermo Fisher Scientific）和50 μL 3%BSA，在4 ℃下儲存30 min；在4 ℃下以400×g離心10 min，去除上清液；50 μL 0.05 mol/L 甘氨酸鹽酸（pH=3.0）添加到沉淀物中并渦旋混勻10 s；添加0.45 mL DBS?2、2 g/100 mL BSA、0.10%吐溫20和抑制劑混合物后，將懸浮液渦旋混合，并在37 ℃下孵育10 min；所有樣品均儲存在-80 ℃下直至酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

1.3 外泌體的驗(yàn)證觀察神經(jīng)源性外泌體固定在適合用于透射電子顯微鏡（TEM）的銅網(wǎng)柵上。銅網(wǎng)上的外泌體用草酸鈾酰和甲基纖維素溶液呈陰性染色。使用Talos F200C TEM（Thermo Fisher Sci?entific）進(jìn)行成像。以細(xì)胞裂解液作為陽性對照，用小鼠抗人CD63 抗體（1∶1 000，abcam）及TSG101抗體（1∶1 000，abcam）進(jìn)行Western blot 以檢測外泌體標(biāo)記物。

1.4 神經(jīng)源性外泌體中T?tau 蛋白及Aβ1?42 含量的測定專用外泌體裂解液（Umibio，中國）裂解外泌體后，采用ELISA 檢測神經(jīng)源性外泌體中Aβ42，T?tau 蛋白的含量。測定神經(jīng)元源性外泌體中CD63 蛋白的含量，校正外泌體的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)量資料組間比較服從正態(tài)分布及方差齊性時(shí)采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗凝治療對認(rèn)知功能的影響房顫患者抗凝治療和無抗凝治療時(shí)的認(rèn)知功能MMSE 評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，25.48±4.15vs.20.58±5.26，P<0.001）；抗凝治療與未抗凝治療兩組間認(rèn)知功能正常、輕度認(rèn)知功能障礙與癡呆分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，Z=-4.275，P<0.001）。

圖1 抗凝治療組間MMSE 比較Fig.1 Comparison of MMSE between anticoagulant treatment groups

圖2 抗凝治療組間認(rèn)知功能分布差異Fig.2 Distribution difference of cognitive function between anticoagulant treatment groups

采用二元logistic 回歸方法分析房顫患者認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素，以輸入法作為自變量篩選方法，教育程度及房顫病程變量作為連續(xù)變量輸入模型（表2），分析患者年齡、性別、教育程度、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、房顫病程以及未抗凝治療與認(rèn)知功能障礙之間的關(guān)系（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)教育程度是房顫患者認(rèn)知功能的保護(hù)因素（B=-0.526，P<0.001），房顫患者未抗凝治療較抗凝治療患者認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（OR=5.024，95%CI：1.584～15.936，P<0.01），證明房顫的抗凝治療是認(rèn)知功能的保護(hù)因素。自變量間多重共線性診斷的標(biāo)準(zhǔn)是容差>0.1 和差異膨脹系數(shù)<10，未發(fā)現(xiàn)共線性存在。

表2 房顫患者認(rèn)知功能影響因素的變量賦值Tab.2 Assignment of influencing factors of cognitive function in patients with atrial fibrillation

表3 房顫患者認(rèn)知功能影響因素的logistic 分析結(jié)果Tab.3 Results of logistic analysis on influencing factors of cognitive function in patients with atrial fibrillation

2.2 外泌體的觀察確認(rèn)透射電子顯微鏡下可以觀察到大小均勻、形態(tài)一致的呈圓形或橢圓形囊泡的血漿外泌體（圖3）可見其膜性結(jié)構(gòu)。Western blot 分析證實(shí)了CD63 及TSG101 在外泌體樣本中的表達(dá)（圖4）。

圖3 透射電子顯微鏡觀察血漿外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.3 Morphological structure of plasma exosomes observed by transmission electron microscope

圖4 CD63 抗體及TSG101 抗體Western blot 檢測結(jié)果Fig.4 Western blot detection of CD63 antibody and TSG101 antibody

2.3 抗凝治療對血漿神經(jīng)源性外泌體中T?tau 蛋白及Aβ1?42 含量的影響T?tau 蛋白及Aβ1?42 在兩組中的含量分布如表4所列，抗凝治療組患者血漿神經(jīng)源性外泌體中T?tau 和Aβ1?42 的含量顯著低于未抗凝治療組（表4，P<0.001）。

表4 T?tau 蛋白及Aβ1?42 在兩組中的含量Tab.4 Contents of t?tau protein and Aβ1?42 in the two groups x±s，pg/mL

3 討論

房顫是發(fā)病率最高的心律失常，同時(shí)是已證實(shí)的認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［5-7］。本研究結(jié)果中校正人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征和共病條件后，房顫患者未抗凝治療較抗凝治療，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)是5 倍，證實(shí)抗凝治療對房顫患者的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用。已有大量研究證實(shí)進(jìn)行抗凝治療能顯著降低房顫患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)［8］。抗凝藥物種類選擇在降低癡呆風(fēng)險(xiǎn)上是否存在差異尚有爭議。有研究顯示長期服用華法林與新型口服抗凝藥（new oral anticoagulants，NOAC）對比，在降低認(rèn)知功能減退和癡呆的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上并無顯著差異［9］。也有大量研究、系統(tǒng)回顧和薈萃分析表明，NOAC 在預(yù)防房顫癡呆方面優(yōu)于華法林［10-13］。

本試驗(yàn)中房顫患者未抗凝治療組輕度認(rèn)知功能障礙及癡呆的發(fā)生率顯著增加，同時(shí)定量檢測患者T?tau 蛋白及Aβ1?42 這兩種阿爾茨海默病的標(biāo)志蛋白，對比兩組中蛋白含量差異，發(fā)現(xiàn)抗凝治療組患者血漿神經(jīng)源性外泌體中T?tau 和Aβ1?42的含量顯著低于未抗凝治療組，從而進(jìn)一步證明房顫患者的抗凝治療不僅有助于預(yù)防栓塞事件，同時(shí)對患者的認(rèn)知功能有明顯的保護(hù)作用，能夠顯著降低房顫患者認(rèn)知功能障礙和癡呆的風(fēng)險(xiǎn)。房顫患者的認(rèn)知功能障礙可能由退行性疾病引起，主要類型為阿爾茨海默病，但其分子機(jī)制尚不清楚。阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致癡呆的主要原因，尤其以β?淀粉樣蛋白沉積形成老年斑及tau 蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)為主要特征［14］。β?淀粉樣蛋白中由40 個和42 個氨基酸殘基組成的Aβ1?40和Aβ1?42 含量最多，大量Aβ 沉積，形成以Aβ 為核心的無法溶解的纖維蛋白斑塊即老年斑［15］。病理情況下，大量過度磷酸化的tau 蛋白失去了結(jié)合微管的能力，容易沉積聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)。在基于人群的尸檢研究中，與無房顫病史的人群相比，如老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的AD 神經(jīng)病理學(xué)變化，在房顫的人群中更常見，提示房顫可能與AD 的神經(jīng)病理學(xué)改變有關(guān)。房顫誘發(fā)認(rèn)知功能損害可能有不同的機(jī)制，腦灌注不足、微出血、微栓塞和其他異常血流動力學(xué)過程被認(rèn)為是房顫患者發(fā)生CI 的可能機(jī)制［16-17］。同時(shí)炎癥和血腦屏障損傷可能是房顫患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的相關(guān)機(jī)制［18］。

由于血腦屏障存在，導(dǎo)致外周血檢測神經(jīng)源性蛋白困難，本試驗(yàn)采用免疫沉淀法富集神經(jīng)源性外泌體，進(jìn)而檢測神經(jīng)源性外泌體中相關(guān)蛋白含量。外泌體尺寸非常小，并具有細(xì)胞膜樣結(jié)構(gòu)，使它們能夠輕松地穿過血腦屏障。例如，在tau 基因敲除小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射放射性標(biāo)記的tau 蛋白，然后觀察到來自神經(jīng)源性外泌體的相應(yīng)tau 蛋白［19］，表明外泌體可以攜帶生物物質(zhì)穿過腦細(xì)胞及血腦屏障。一項(xiàng)多中心兩階段的研究顯示，T?tau 和Aβ1?42 以神經(jīng)源性外泌體為載體的濃度與其腦脊液中含量具有相同的診斷AD 和輕度認(rèn)知功能障礙的能力［20］。上述數(shù)據(jù)表明，外周血神經(jīng)源性外泌體是篩選認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)退行性生物標(biāo)志物的良好載體。

本研究存在一些局限性，不能完全排除無明顯臨床癥狀的微血栓形成事件，抗凝治療可減少微血栓事件的發(fā)生，從而保護(hù)房顫患者的認(rèn)知功能，因此不能完全排除血管性癡呆對結(jié)論的干擾。本研究入選永久性房顫患者時(shí)排除既往腦血管病史患者，以上篩選條件導(dǎo)致符合入選條件的樣本例數(shù)受限，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步支持本研究結(jié)論。本研究首次檢測分析了房顫合并認(rèn)知功能障礙患者外周血神經(jīng)源性外泌體為載體的T?tau 蛋白及Aβ1?42 含量，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行抗凝治療的房顫患者其生物標(biāo)志物水平顯著低于未抗凝治療組，進(jìn)一步證實(shí)了抗凝治療對房顫患者的認(rèn)知損害有保護(hù)作用，提示抗凝藥物有預(yù)防延緩認(rèn)知功能障礙及癡呆的發(fā)生。臨床可以參考生物標(biāo)志物早期識別認(rèn)知功能障礙并積極預(yù)防，同時(shí)應(yīng)指導(dǎo)患者合理選擇抗凝藥物，預(yù)防栓塞事件同時(shí)預(yù)防認(rèn)知功能障礙及癡呆的發(fā)生。