董 靜 陳 萍 呂艷欣 李鵬輝 王 玉

(齊齊哈爾醫(yī)學院 黑龍江 齊齊哈爾 161000)

肝癌是一種發(fā)生于肝臟的癌癥，早期肝癌通常沒有任何癥狀，隨著疾病進展，患者可能出現(xiàn)不明原因的體重減輕、食欲不振、少量進食就感覺很飽、反復有惡心或嘔吐等癥狀。肝癌細胞發(fā)生的分子機制方面，一般包括了癌基因還有抑癌基因的突變，除了這兩個之外，也有生長因子在失控方面的表達等[1]。DcR3屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)的一個成員，這個指標可以采用競爭的方法對相關信號的轉導和通路起到阻斷的作用，可以對細胞的增殖情況起到調節(jié)的作用，控制住細胞的凋亡。基于此，本文通過探究DcR3表達在肝癌細胞凋亡和增殖中的作用，為肝癌細胞分子治療與預后提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人肝癌細胞株HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H這些都是從北京中科質檢生物技術有限公司提供的，然后DMEM培養(yǎng)液還有胰蛋白酶等是由美國Hyclone公司提供的；上海吉凱基因化學技術有限公司提供的有LV-DcR3、LV-NC這兩個物質；美國Abcam公司則是生產了鼠抗DcR3單克隆抗體，武漢艾美捷科技有限公司是生產了鼠抗CADPH單克隆抗體；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR由日本Takara公司提供。

1.2 方法

(1)細胞培養(yǎng)：肝癌的細胞株里面HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H都是使用了10%濃度的胎牛血清，并對青鏈霉素DMEM進行培養(yǎng)，劑量都是100U/mL，在37℃的溫度下、5%的CO2培養(yǎng)箱里面進行常規(guī)的培養(yǎng)；取對數(shù)期的細胞，一般情況下每個孔都是3×105個細胞接種，大概是6個孔板；在細胞的密度在80%以上的時候再進行LV-DcR3、LV-NC；在感染之前把培養(yǎng)基扔掉，使用新的，然后根據(jù)相關病毒滴度測定的結果加入病毒的上清，大概是MIO 50TU/mL，同樣在37℃的溫度下、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，然后在12小時之后更換培養(yǎng)基，72小時之后觀察感染的情況。之后再對相關細胞進行收集并檢測蛋白免疫的印記還有細胞生長的曲線。(2)對DcR3蛋白進行檢測：使用細胞裂解液將細胞裂解，并使用BCA的蛋白定量試劑盒進行定量之后，把上樣緩沖液加進去攪拌均勻之后，在100℃的情況下進行變性，大概10分鐘，然后進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后開始濕轉，大概10分鐘，結束之后把其轉移到PVDF膜的位置上，再使用脫脂奶粉封閉液進行封閉，濃度大概是5%，時間是2小時；一抗按照比例加入，在4℃的溫度下孵育一夜，使用磷酸鹽緩沖液進行3次漂洗，每次都是10分鐘；然后再進行二抗，需要在室內正常的溫度下進行孵育，時間大概是1小時，然后再進行漂洗，也是需要3次，每次的時間減少到5分鐘，最后觀察檢測出來的結果。(3)對mRNA表達的水平進行檢測：需要先把細胞里面的RNA提取出來，使用的方法是Trizol，然后再把總RNA的1μg mRNA反轉錄成cDNA，使用的試劑盒是逆轉錄試劑盒，轉錄的時候需要在42℃的條件下進行，時間大概是60分鐘，然后在70℃的溫度下重復一次，時間是5分鐘。qPCR：PCR反應體系為20μL是這個PCR反應的一個體系，一般情況下每個孔都需要3個復空，然后進行預變性，溫度是95℃，大概需要2分鐘，然后在95℃條件下預變性15秒、60℃的條件下預變性34秒，進行40個循環(huán)。

1.3 觀察指標

2 結果

2.1 不同肝癌細胞株DcR3蛋白、mRNA表達

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞株的DcR3蛋白表達水平要低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05；HepG2在mRNA表達水平中明顯低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05，如下表。

表1 不同肝癌細胞株DcR3蛋白、mRNA表達

2.2 上調DcR3表達后凋亡指標轉錄水平

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，LV-DcR3組caspase-3、Bax低于LV-NC組，Bcl-2則高于LV-NC組，P<0.05，如下表。

表2 上調DcR3表達后凋亡指標轉錄水平

3 討論

在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展里面，DcR3這個指標有著比較重要的作用，而且這個基因也是屬于TNFR超家族的一個成員，也就是說該指標和TNFR有著較高的同源性，可以通過一些介導細胞的凋亡，還有蛋白分子的胚體進行結合，這樣可以對后者物質介導的細胞凋亡起到阻斷的作用[2]。其次，這個基因可以對T細胞進行阻斷，也可以對腫瘤細胞的凋亡進行阻斷，阻斷的方式各式各樣，所以這個基因在很多種惡性的腫瘤發(fā)生和發(fā)展方面有著比較重要的作用。

本次研究里面對DcR3的慢病毒進行建立，并對其表達的水平進行轉染，轉染成比較低的HepG2細胞，然后再驗證轉染的效率。不過在對這個基因的表達進行上調之后可以看出，能夠進一步促進HepG2這個細胞株在增殖還有抗凋亡方面的能力[3]。Caspase-3在細胞凋亡中起到了重要作用，因為活化的Caspase-3是可以引起細胞凋亡，但是這個過程也是可以被Bcl-2進行阻斷[4]。在本次的研究中發(fā)現(xiàn)，LV-DcR3組caspase-3低于LV-NC組，可以表明這個基因在肝癌細胞進行凋亡的時間段里面起到了比較重要的作用。本次研究結果中發(fā)現(xiàn)，在對這個基因的表達進行下調的時候，可以看出肝癌細胞里面HepG2這個細胞的增殖能力發(fā)生了比較明顯的下降，也就是說這個指標在一定程度上是可以對相關細胞的增殖進行控制的。但由于相關研究較少，需進一步研究其是如何進行調控，只有這樣才可以在-為這個疾病的患者進行治療的時候提供比較科學的基礎。

綜上所述，在肝癌細胞進行增殖還有抗凋亡方面，DcR3這個基因都是有著比較重要的作用，因為其和上調抗癌基因的表達方面有著比較密切的關系。