張 坦，賈曉蘭，曹 麗，楊 明，傅占江，代曉朋

HBV感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題。全球有約20億人感染過HBV，慢性HBV攜帶者超過2.5億，每年約80萬患者死于HBV相關(guān)的疾病[1]。慢性HBV感染導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的肝損傷和癌變，最終可發(fā)展為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。據(jù)報(bào)道，雖然疫苗接種有效降低了新生兒HBV感染率，但如果不采取干預(yù)措施，2015—2030年將累計(jì)將出現(xiàn)6300萬例新的慢性HBV感染者和1700萬例HBV相關(guān)死亡病例[2]。干擾素和核苷酸/核苷類似物等藥物可抑制HBV復(fù)制并緩解肝臟病變，但停藥后病毒易復(fù)發(fā)、長(zhǎng)時(shí)間用藥可導(dǎo)致病毒耐藥突變和其他不良反應(yīng)等限制了治療效果，并且無法徹底根除患者體內(nèi)的HBV cccDNA[3]。目前，HBV在人肝細(xì)胞中建立持續(xù)感染和致病的分子機(jī)制尚不清楚，通過尋找新的HBV感染和致病靶點(diǎn)，開發(fā)耐受性更好的治療策略，對(duì)于治療和預(yù)防HBV感染和致病至關(guān)重要。

微 小 RNA（microRNA, miRNA） 是 由19～23個(gè)核苷酸組成的小的非編碼RNA，通過與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的3’-非翻譯區(qū)（untranslated regions, UTR）配對(duì)，抑制翻譯和/或降解mRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、癌變、抗病毒等多種生物過程中發(fā)揮重要作用[4]。

miRNA是HBV-宿主相互作用的重要調(diào)節(jié)因子，參與了HBV感染、復(fù)制和HBV相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)[5]。人體內(nèi)的miRNA可通過直接與HBV轉(zhuǎn)錄本結(jié)合影響HBV復(fù)制，或通過靶向與HBV生命周期相關(guān)的細(xì)胞因子間接影響HBV復(fù)制。反之，HBV感染可導(dǎo)致細(xì)胞miRNA表達(dá)水平的變化，這些miRNA參與調(diào)節(jié)在HBV致病中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞基因和信號(hào)通路，在HBV致病中發(fā)揮重要作用。

1 宿主細(xì)胞miRNA調(diào)控HBV復(fù)制和表達(dá)

1.1 直接抑制HBV復(fù)制和表達(dá) 宿主細(xì)胞的miRNA可以直接與HBV轉(zhuǎn)錄本結(jié)合進(jìn)而抑制HBV復(fù)制和表達(dá)。Zhang等[6]首先發(fā)現(xiàn)了能夠直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄本的miRNA，他們?cè)贖epG2.2.15細(xì)胞中通過功能缺失的方法，分別敲除328個(gè)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p和miR-210可有效降低HBV復(fù)制和HBsAg表達(dá)水平。通過生物信息學(xué)分析顯示，miR-199a-3p和miR-210分別通過直接靶向HBV基因組的HBsAg編碼區(qū)和前S1區(qū)，進(jìn)而抑制HBV復(fù)制和表達(dá)。Potenza等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5 p的種子序列與HBV表面抗原的編碼序列互補(bǔ)配對(duì)，抑制病毒表達(dá)，從而減少HBsAg分泌量，進(jìn)而還可能抑制HBV復(fù)制。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關(guān)的miRNA，包括miR-15a/miR-16-1[8]、miR-20a 及 miR-92a-1[9]、miR-1236[10]都可以直接與HBV mRNA互補(bǔ)配對(duì)并抑制HBV復(fù)制和表達(dá)。在HBV的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟表達(dá)豐度最高且具有肝臟特異性的miR-122可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向HBV聚合酶mRNA和核心蛋白mRNA的3’-UTR，抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，臨床試驗(yàn)進(jìn)一步表明，HBV陽性患者體內(nèi)miR-122水平與外周血單個(gè)核細(xì)胞中的病毒載量呈負(fù)相關(guān)，表明miR-122可抑制HBV復(fù)制，導(dǎo)致HBV的持續(xù)/慢性感染[11]。

1.2 間接抑制HBV復(fù)制和表達(dá) 某些宿主細(xì)胞的miRNA雖然在HBV基因組中沒有直接的結(jié)合位點(diǎn)，但可以通過靶向其他宿主因子，通過作用于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子而間接調(diào)節(jié)HBV復(fù)制。HBV的轉(zhuǎn)錄主要受4個(gè)啟動(dòng)子（即核心、前S1、前S2/S和X啟動(dòng)子）和2個(gè)增強(qiáng)子（ENI和ENII）的調(diào)節(jié)，它們?cè)贖BV復(fù)制中起著關(guān)鍵作用[12]。核因子I（nuclear factor I, NFI）是一種位點(diǎn)特異性的DNA結(jié)合蛋白，由NFIA、NFIB、NFIC、NFIX 4種蛋白轉(zhuǎn)錄因子組成，可以特異性結(jié)合HBV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，影響HBV復(fù)制[13]。NFIA可直接調(diào)節(jié)HBV增強(qiáng)子I活性來促進(jìn)HBV復(fù)制。Fan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-370可以靶向抑制NFIA，降低HBV增強(qiáng)I/C啟動(dòng)子活性，進(jìn)而抑制HBV復(fù)制和表達(dá)。富含半胱氨酸和組氨酸的結(jié)構(gòu)域1（cysteine- and histidine-rich domain containing 1,CHORDC1）是一種熱休克蛋白，能夠通過促進(jìn)HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的活性而促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-26b通過直接抑制CHORDC1的表達(dá)而抑制HBV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子活性，抑制HBV轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)和復(fù)制。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR） 由 PPARA、PPARB和PPARC組成，是屬于核激素受體超家族的配體激活轉(zhuǎn)錄因子[16]。PPARA與HBV基因組前RNA合成和病毒復(fù)制相關(guān)，在HBV核心啟動(dòng)子、前S1啟動(dòng)子、X啟動(dòng)子、ENI和ENII都含有PPARA結(jié)合位點(diǎn)，PPARA可反式激活HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[17]。Hu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-141通過直接與PPARA mRNA 3’-UTR結(jié)合抑制PPARA表達(dá)，降低HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。此外，miR-29c通過靶向腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3降低S1啟動(dòng)子活性[19]，miR-185-5p通過直接靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1抑制S1啟動(dòng)子活性[20]，從而最終抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。肝臟的富含的轉(zhuǎn)錄因子和核受體可以結(jié)合HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件，并在激活和調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，miRNA通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子，間接調(diào)節(jié)HBV復(fù)制和表達(dá)。

1.3 促進(jìn)HBV復(fù)制與表達(dá) 目前尚無miRNA直接靶向HBV促進(jìn)病毒復(fù)制其復(fù)制和表達(dá)的報(bào)道，某些miRNA可通過靶向宿主基因促進(jìn)HBV復(fù)制和表達(dá)。HBx相互作用蛋白（hepatitis B X-interacting protein, HBXIP）是一種與HBx蛋白結(jié)合的人類蛋白，可通過與HBx相互作用來降低 HBV復(fù)制。miR-501通過靶向抑制HBXIP表達(dá)，增強(qiáng)HBV復(fù)制[21]?；罨腟TAT 2蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT 2, PIAS2）是轉(zhuǎn)錄蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活劑，通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在HBV感染中，PIAS2可抑制HBV復(fù)制和表達(dá)。miR-137能夠靶向抑制PIAS2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)[22]。干擾素介導(dǎo)的抗病毒作用是細(xì)胞對(duì)病毒感染反應(yīng)的重要組成部分。miRNA-548可以直接靶向并抑制干擾素-λ1的表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主抗病毒反應(yīng)，有助于HBV感染和復(fù)制[23]。以上促進(jìn)HBV復(fù)制的miRNA，大多是通過調(diào)控宿主體內(nèi)影響HBV復(fù)制的負(fù)性細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的模式發(fā)揮作用。

miRNA通過靶向HBV自身的調(diào)節(jié)因子促進(jìn)HBV復(fù)制和表達(dá)。NFIB是一種下調(diào)HBV增強(qiáng)子I和核心啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄因子。miR-372/373能夠直接靶向抑制NFIB的表達(dá)，增強(qiáng)HBV增強(qiáng)子I和核心啟動(dòng)子活性，進(jìn)而促進(jìn)HBV表達(dá)[24]。SMARCE1是染色質(zhì)重塑復(fù)合物家族的成員，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在HBV感染中，SMARCE1通過與HBV核心啟動(dòng)子結(jié)合抑制HBV的表達(dá)和復(fù)制[25-26]。miR-802和miR-29a都可以通過靶向抑制SMARCE1，促進(jìn)HBV核心啟動(dòng)子活性，進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制和表達(dá)[25-27]。E盒結(jié)合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2,ZEB2）是ZEB轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，在參與腫瘤發(fā)生的TGF-β/BMP通路中發(fā)揮重要作用。在HBV感染中，ZEB2通過靶向抑制HBV核心啟動(dòng)而抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)[28]。miR-146可以直接靶向抑制ZEB2的表達(dá)，提高HBV核心啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)[29]。此外，miR-15b[30]，miR-1[31]等都是通過間接調(diào)節(jié)HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)。

miRNA還可在表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)控HBV的復(fù)制和表達(dá)。HBV cccDNA的甲基化和去乙?；缺碛^遺傳修飾，通過調(diào)控HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，在控制HBV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；腔虮磉_(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，組蛋白的乙?；龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，而組蛋白的去乙酰化抑制轉(zhuǎn)錄，這一過程主要由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase,HDAC）調(diào)節(jié)。HDAC4調(diào)節(jié)HBV cccDNA結(jié)合組蛋白的去乙?；?，抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。miR-1和miRNA-548ah通過直接與HDAC4結(jié)合抑制HBV cccDNA結(jié)合組蛋白的去乙?；?，提高HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)[31-32]。

miRNA還可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的自噬，影響HBV的復(fù)制和表達(dá)。自噬參與先天免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物的識(shí)別，有利于病原體的吞噬和清除。研究表明，在HCC細(xì)胞系中通過抑制中的Akt/mTOR信號(hào)通路可以增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬，從而正向調(diào)節(jié)HBV復(fù)制。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)miR-192-3p可通過靶向X連鎖的凋亡抑制蛋白調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而刺激細(xì)胞自噬，促進(jìn)HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。鋅指蛋白143（zinc finger protein 143, ZNF143）是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者血清miR-192-3p水平與HBV DNA和HBsAg水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，miR-192-3p通過靶向HepG2細(xì)胞中ZNF143來抑制Akt/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。miR-155可以靶向細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（suppressor of cytokine signaling, SOCS）1抑制Akt/mTOR信號(hào)通路，刺激細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)HBV的復(fù)制與表達(dá)[35]。此外，miR-146a-5p介導(dǎo)的MDM2/p53軸在自噬過程的起始階段誘導(dǎo)肝細(xì)胞的自噬，進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制[36]。

2 宿主細(xì)胞miRNA參與HBV致病

慢性HBV感染可導(dǎo)致肝炎、肝硬化，甚至HCC，這一復(fù)雜過程涉及肝細(xì)胞反復(fù)破壞和再生等多種遺傳和表觀遺傳變化，在這些改變中，miRNA異常表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。

2.1 miRNA與肝臟炎癥 HBV是一種非致細(xì)胞病變病毒，HBV感染引起宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟炎癥。miRNA在HBV所致的肝臟炎癥中發(fā)揮重要作用。Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)，HBx通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)先天免疫相關(guān)miR-146a的表達(dá)，補(bǔ)體因子H（complement factor H, CFH）是補(bǔ)體激活替代途徑的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，miR-146a靶向抑制CFH表達(dá)，促進(jìn)導(dǎo)致 肝臟炎癥。HBx-miR-146a-CFH-補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)通路介導(dǎo)了HBV感染所導(dǎo)致的肝臟炎癥。HBeAg通過PI3K和NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，增加的miR-155通過抑制BCL-6、SHIP-1和SOCS-1的表達(dá)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-122、miR-132在肝臟炎癥相關(guān)的先天性和適應(yīng)性免疫中具有重要功能[39]，同時(shí)也受HBV的調(diào)控，在HBV所介導(dǎo)的肝臟炎癥中的作用及機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究。

2.2 miRNA與HBV相關(guān)的肝纖維化和肝硬化 HBV感染產(chǎn)生的細(xì)胞外間質(zhì)不平衡引起持續(xù)性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化。肝星狀細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）是肝纖維化相關(guān)的主要效應(yīng)因子。Guo等[40]鑒定了在HSC激活過程中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA通過不同的信號(hào)通路參與HSC激活，在肝臟纖維化過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，母親信號(hào)蛋白同源物7（drosophila mothers against decapentaplegic protein 7,Smad7）表達(dá)的缺失或抑制與組織纖維化、炎性疾病以及腫瘤等密切相關(guān)[41]。Huang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞HSC miR-33a水平升高，miR-33a通過直接靶向抑制Smad7的表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展。

2.3 miRNA與HBV相關(guān)HCC HCC是最常見的惡性腫瘤之一，在亞洲90%的HCC是由HBV感染引起。盡管在HBV相關(guān)HCC的早期診斷和治療方法方面已取得顯著進(jìn)展，但是HBV促進(jìn)HCC發(fā)展的詳細(xì)分子機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為癌基因或抑癌基因在HBV相關(guān)HCC發(fā)生中起重要作用。Li等[43]對(duì)與HBV和HCV相關(guān)HCC患者的血清進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)13個(gè)miRNAs在HBV相關(guān)HCC病例中存在表達(dá)差異，可以準(zhǔn)確區(qū)分HBV攜帶者、HCV攜帶者和健康者，其中miR-375和miR-92a具有HBV特異性。miR-122是肝臟中含量最高的miRNA，占肝臟總miRNAs含量的70%。N-myc下游調(diào)節(jié)基因3（N-myc downstream-regulated gene, NDRG3）是一種腫瘤激活因子，導(dǎo)致腫瘤的惡性表現(xiàn)，在HBV相關(guān)HCC的臨床腫瘤標(biāo)本和表達(dá)HBV抗原的HepG2.2.15細(xì)胞系中均高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122抑制了NDRG3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的惡性表型，其通過靶向NDRG3在HBV相關(guān)的HCC發(fā)生中發(fā)揮重要作用[44]。在另一項(xiàng)研究中，HBV感染導(dǎo)致miR-122水平降低，促進(jìn)垂體瘤轉(zhuǎn)化基因結(jié)合因子的過度表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[45]。此外，miR-122表達(dá)降低與細(xì)胞周期蛋白G1的上調(diào)有關(guān)，它促進(jìn)了鼠雙微基因2（一種p53的阻遏蛋白）的去磷酸化，并導(dǎo)致HCC細(xì)胞的增殖[46]。研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染中，參與抑制細(xì)胞增殖的miRNAs（miR-15 b、miR-22、miR-26a/b、miR-29c、miR-145 和 miR-199-a-3 p）在HBV相關(guān)HCC中表達(dá)下調(diào)，而一些癌基因樣miRNAs（miR-17-92簇和miR-21、miR-181a、miR-143、miR-602）在HBV相關(guān)HCC中表達(dá)上調(diào)，這些異常表達(dá)的miRNAs在促進(jìn)HCC過程中發(fā)揮重要作用[47]。

2.4 HBV編碼miRNA與HBV致病 2017年，Yang等[48]首次發(fā)現(xiàn)一種HBV編碼miRNA—HBV-miR-3，其在HBV感染的組織和細(xì)胞中高表達(dá)。在HBV感染患者體內(nèi)，HBV-miR-3通過外泌體和HBV病毒粒子釋放到血液循環(huán)中，HBV-miR-3的表達(dá)水平與HBV感染急性期患者血清中的HBV載量呈正相關(guān)，HBV-miR-3可通過抑制HBV轉(zhuǎn)錄而抑制HBV的復(fù)制，表明HBV編碼的miRNA在HBV感染過程中，通過調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄本來控制自我復(fù)制。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)可能有助于解釋HBV感染如何導(dǎo)致肝細(xì)胞輕度損傷和維持持續(xù)感染的情況。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，HBV-miR-3可以調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)[49]。SOCS5是HBV-miR-3的直接靶點(diǎn)，SOCS5的其下調(diào)可以激活STAT1，導(dǎo)致HBV感染HCC細(xì)胞中干擾素激活基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)干擾素的抗病毒作用；HBV-miR-3通過SOCS5/STAT1途徑還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化。Yao等[50]發(fā)現(xiàn)了另一種HBV編碼的miRNA——HBV-miR-2。HBV-miR-2通過直接靶向抑制TRIM35的表達(dá)和上調(diào)RAN表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)遷移和侵襲，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖。HBV編碼miRNA的發(fā)現(xiàn)有助于深入理解HBV的感染和致病機(jī)制，為HBV感染的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

3 小 結(jié)

miRNA在宿主-病毒相互作用中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞miRNA可以通過直接結(jié)合HBV轉(zhuǎn)錄物或通過靶向與HBV生命周期相關(guān)的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。反過來，HBV感染可改變細(xì)胞miRNA水平。HBV編碼的miRNA還可調(diào)節(jié)病毒感染狀態(tài)和病毒生命周期。

隨著我們對(duì)miRNA的研究不斷深入，HBV對(duì)細(xì)胞miRNA的影響以及miRNA在HBV感染和HBV相關(guān)HCC的發(fā)展過程中所起的作用將逐漸清晰。在肝病的不同臨床階段，血清/血漿中miRNA表達(dá)譜的改變?yōu)閙iRNA作為非侵入性生物標(biāo)記物的應(yīng)用開辟了新的視角。

在臨床應(yīng)用方面，目前廣泛用于抗病毒治療的核苷/核苷酸類似物以及大多數(shù)細(xì)胞因子藥物其作用機(jī)理主要在HBV RNA轉(zhuǎn)錄后起作用抑制病毒復(fù)制，不直接影響其基因表達(dá)；而miRNA在轉(zhuǎn)錄水平上控制HBV，同時(shí)限制HBV復(fù)制和基因表達(dá)。因此，在HBV感染治療策略上基于miRNA的治療具有很好的前景，是HCC治療的潛在生物靶點(diǎn)。