關(guān)冀弛 劉丹 陳艷閣 樊雪 汪海峰

(1 沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142； 2 遼寧成大生物股份有限公司)

神經(jīng)細(xì)胞二維(2D)貼壁培養(yǎng)是傳統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，常應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞Neuro-2A[1]、SH-SY5Y[2]和PC12[3]等的培養(yǎng)。這種2D培養(yǎng)方法成本低、操作簡便，且細(xì)胞生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng)。然而，正常的神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在三維(3D)空間形成的，2D細(xì)胞培養(yǎng)不具備體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞生長的環(huán)境，難以模擬細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用[4-5]，因此可能會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的部分基因、蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響。而通過選取利于神經(jīng)細(xì)胞生長的培養(yǎng)材料和方法，可以更加深入地揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制，同時(shí)有助于特異性藥物研發(fā)。

3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能使細(xì)胞在3D空間中生長并發(fā)生相互作用，使細(xì)胞群形成一個(gè)3D立體結(jié)構(gòu)。其優(yōu)勢是在空間方面克服了2D培養(yǎng)方式的弊端，能最大程度地模擬神經(jīng)細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮細(xì)胞的功能，同時(shí)還可支撐神經(jīng)細(xì)胞的黏附和伸展分化。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅能模擬腦部高度復(fù)雜化的3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還能進(jìn)一步分析腦內(nèi)炎癥情況[6]。目前，神經(jīng)細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)可分為兩大類：無支架培養(yǎng)法和支架培養(yǎng)法。

1 無支架培養(yǎng)法

無支架培養(yǎng)法是以細(xì)胞本身的附著力為基礎(chǔ)，使細(xì)胞聚集成3D結(jié)構(gòu)。主要包括以下幾種方法：神經(jīng)球法、懸滴培養(yǎng)法、微重力旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)法(RCCS)及磁性納米粒子培養(yǎng)法等。

1.1 神經(jīng)球法

將神經(jīng)細(xì)胞聚集成團(tuán)狀物細(xì)胞集合體，在3D環(huán)境下形成細(xì)胞球[7]。這種培養(yǎng)方式操作便捷、易于大規(guī)模培養(yǎng)。然而這種培養(yǎng)方式存在一定的不足：大量神經(jīng)細(xì)胞集中于“神經(jīng)球”的內(nèi)部，缺乏運(yùn)輸養(yǎng)分和代謝產(chǎn)物的通道。隨著“神經(jīng)球”的不斷增大，“神經(jīng)球”內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的交換會(huì)出現(xiàn)困難，影響內(nèi)部細(xì)胞進(jìn)一步增長，甚至使內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生凋亡及壞死，出現(xiàn)中空的現(xiàn)象。因此這種方法培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞體積會(huì)受到限制，神經(jīng)球的培養(yǎng)周期和藥物處置時(shí)間亦不能太久。

1.2 懸滴培養(yǎng)法

利用表面張力將細(xì)胞懸液滴置于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板底部，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使液滴內(nèi)部的細(xì)胞在重力及細(xì)胞間附著力的作用下聚集成3D結(jié)構(gòu)[8]。此方法操作比較簡便，不需要特別的儀器設(shè)備。其缺點(diǎn)是液體的表面張力無法支撐質(zhì)量和體積較大的細(xì)胞懸液，因此細(xì)胞懸滴液體的體積一般局限在50 μL以內(nèi)，從而細(xì)胞數(shù)量受限。同時(shí)這種培養(yǎng)方法在后續(xù)的藥物處理及形態(tài)觀察上操作繁瑣，容易失誤，難以用于大規(guī)模培養(yǎng)。

1.3 RCCS

RCCS主要由同軸旋轉(zhuǎn)的氧化器和細(xì)胞培養(yǎng)容器組成[9]。系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)部充滿培養(yǎng)基，且這些培養(yǎng)基可以緊緊圍著水平軸進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)。在旋轉(zhuǎn)過程中，培養(yǎng)基均以相同的角速度轉(zhuǎn)動(dòng)，培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞在重力、離心力及科氏力的共同作用下呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，進(jìn)而聚集形成了類組織3D聚合物。在RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞不僅受到的機(jī)械外力較小，還能夠得到充足的營養(yǎng)以及氧氣等必備物質(zhì)，可有效促進(jìn)各種細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化[10]，利于細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)[11]。同時(shí)RCCS無須推進(jìn)器和攪拌器輔助，剪切力極低，對(duì)細(xì)胞傷害小，特別適合神經(jīng)細(xì)胞的生長。旋轉(zhuǎn)式發(fā)酵罐容積可以做的較大，適合于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)[12]。CUI等[13]利用膠原海綿材料建立微重力環(huán)境的RCCS培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，通過免疫熒光染色檢測神經(jīng)分化標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)RCCS系統(tǒng)中膠原海綿培養(yǎng)的NSCs具有良好的神經(jīng)元分化和遷移能力，有助于NSCs的培養(yǎng)和分化。

1.4 磁性納米粒子培養(yǎng)法

該方法主要采用噬菌體、氧化鐵磁性粒子及金納米復(fù)合顆粒。噬菌體感染細(xì)胞后，磁性納米顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在外部磁場的作用下，包含磁性粒子的細(xì)胞產(chǎn)生磁性，同時(shí)通過對(duì)磁場的空間控制，調(diào)控細(xì)胞群的幾何形狀[14]。沈亦雯等[15]通過快速聚集無血清懸浮培養(yǎng)法誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)前體細(xì)胞和皮質(zhì)椎體神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞無須外部誘因即可自主轉(zhuǎn)化為狀態(tài)良好的神經(jīng)細(xì)胞，且誘導(dǎo)率極高，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及神經(jīng)組織修復(fù)帶來希望。

2 支架培養(yǎng)法

支架系統(tǒng)主要是將細(xì)胞接種或分散于疏松多孔的細(xì)胞支撐結(jié)構(gòu)支架中，而形成3D形態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。理想支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：無毒且具有良好的生物組織相容性；具有一定孔隙率和良好的表面活性；具有生物可降解性、可塑性和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度；能促進(jìn)細(xì)胞間黏附和增殖。根據(jù)支架材料及制備方式的不同，分為水凝膠支架、脫細(xì)胞支架、靜電紡絲支架，除此之外可制備結(jié)構(gòu)支架的微流控芯片技術(shù)、3D生物打印技術(shù)等也廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的3D培養(yǎng)。

2.1 水凝膠支架

水凝膠由親水聚合物鏈在富水環(huán)境中形成，因其具有良好的生物相容性和3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，近年來越來越多地應(yīng)用于3D細(xì)胞的培養(yǎng)[16-17]。

水凝膠的應(yīng)用較早，分類方法較多，根據(jù)材料種類或來源不同可分為天然水凝膠和合成水凝膠。用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的天然水凝膠材料通常由海藻酸鈉、膠原、氨基酸和多肽類凝膠因子在體外凝集而成。這類支架材料含水量較高、孔隙較大[18]，為細(xì)胞的支撐和細(xì)胞間的物質(zhì)交換提供了良好的環(huán)境。CHEN等[19]建立了3D多孔膠原支架用于神經(jīng)元腫瘤干細(xì)胞(NCSCs)的培養(yǎng)，神經(jīng)元核免疫染色檢測顯示，80 μm多孔膠原支架可以增強(qiáng)NCSCs的附著、分化能力和細(xì)胞活力，為神經(jīng)組織工程和神經(jīng)再生提供了新的研究手段。

合成水凝膠是利用化學(xué)材料人工合成3D結(jié)構(gòu)的高分子，常用材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇等。目前，人工合成的水凝膠已經(jīng)商品化，使用較廣泛的是商品名為Matrigel的凝膠，其可通過改變合成材料的分子量大小和交聯(lián)密度來調(diào)節(jié)孔徑大小及生物降解率等，適合用于多種神經(jīng)細(xì)胞的3D培養(yǎng)[20-21]。LI等[22]制作了D-甘露醇晶體與甲基丙烯酰胺殼聚糖(MAC)混合凝膠支架，研究神經(jīng)干/祖細(xì)胞(NSPCs)于不同孔隙率下的分化機(jī)制。結(jié)果表明隨著孔隙率的增大和培養(yǎng)時(shí)間的延長，NSPCs分化速率明顯增高，分化產(chǎn)生的顆粒細(xì)胞和球周細(xì)胞數(shù)量增加，且較大孔徑的MAC水凝膠可有效地促進(jìn)NSPCs的3D分化。

2.2 脫細(xì)胞支架

脫細(xì)胞支架是采用化學(xué)和物理方法去除組織中的細(xì)胞，形成無免疫原性或低免疫原性的材料，用于構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的支架[23-24]。按照制備方式不同分為物理法和化學(xué)法。常用的物理方法包括高滲鹽法、低滲聯(lián)合凍干法以及反復(fù)凍融法，化學(xué)法主要采用Triton X-100、Sulfobetaine-10(SB-10)、Sulfobetaine-16(SB-16)等針對(duì)神經(jīng)進(jìn)行脫細(xì)胞處理。侯博等[25]通過處理大鼠坐骨神經(jīng)制作成脫細(xì)胞支架，采用Triton X-200、SB-10、SB-16聯(lián)合脫氧膽酸鈉及過氧乙酸處理神經(jīng)組織，去除細(xì)胞核及可導(dǎo)致免疫原性的神經(jīng)纖維髓鞘成分。結(jié)果顯示支架呈現(xiàn)不規(guī)則多孔狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)基底膜管壁結(jié)構(gòu)清晰且保留完整，該方法制備出的支架可最大限度保護(hù)ECM，具有低免疫原性，可有效促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生。

2.3 靜電紡絲支架

靜電紡絲是高分子流體靜電霧化的一種形式，在靜電的作用下霧化分裂出的物質(zhì)不是液滴而是微小射流，然后固化成纖維。通過特定方法可以得到3D結(jié)構(gòu)的納米纖維支架，通過相關(guān)參數(shù)可調(diào)控支架的孔隙度、纖維尺寸和形態(tài)等。靜電紡絲支架模仿了ECM結(jié)構(gòu)，可為神經(jīng)細(xì)胞的生長提供適宜生長環(huán)境，在對(duì)支架表面修飾后，可通過控制生物化學(xué)信號(hào)來調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移以及增殖等一系列生物學(xué)行為[26-27]。MUTHUSAMY等[28]通過靜電紡絲制作生物合成材料作為細(xì)胞支架，進(jìn)行小腦顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，此種支架培養(yǎng)方法明顯促進(jìn)了神經(jīng)軸突的生長。

2.4 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)是一種將細(xì)胞、組織、化學(xué)試劑等樣品從制備、反應(yīng)到分離檢測等多種操作方式高度集中在芯片上的技術(shù)，通過設(shè)計(jì)網(wǎng)格狀微通道，以流體控制整個(gè)系統(tǒng)。該技術(shù)能將實(shí)驗(yàn)微縮到一個(gè)幾平方厘米的芯片上進(jìn)行，因其具有精準(zhǔn)性、便捷性優(yōu)勢，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、疾病診斷、病例研究及藥物篩選等[29]。目前用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片主要以聚二甲基硅氧烷為原料，在其表面雕刻出培養(yǎng)細(xì)胞的微通道，再用膠原溶液或者多聚賴氨酸溶液親水處理后接種細(xì)胞[30-31]。微流控芯片技術(shù)允許在微米、納米級(jí)的通道中對(duì)流體進(jìn)行空間控制，以空間可控的方式共培養(yǎng)多種細(xì)胞，可動(dòng)態(tài)梯度灌注培養(yǎng)，并能實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的精確操作。微流控芯片可實(shí)現(xiàn)NSCs的定向分化，如KIM等[32]研究該技術(shù)對(duì)NSCs的定向分化能力，結(jié)果表明該方法可促進(jìn)NSCs朝著星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，抑制向神經(jīng)元方向分化，為神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸信號(hào)傳遞等過程的研究提供了可能。

2.5 3D生物打印技術(shù)

3D生物打印技術(shù)可以直接將細(xì)胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白質(zhì)、DNA、生長因子等)作為3D打印的基本單元，以3D打印的方式，直接構(gòu)建體外生物結(jié)構(gòu)體、組織或器官模型。

現(xiàn)階段，3D生物打印技術(shù)的仿生對(duì)象通常為ECM[33-34]。ECM中富含膠原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白，這些蛋白在提供支撐作用的同時(shí)，還可結(jié)合生長因子，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過程。3D生物打印技術(shù)可制備完整的ECM支架，用于ECM組成、空間分布和生物學(xué)功能的分析[35]。利用3D生物打印技術(shù)精準(zhǔn)調(diào)控功能性材料的呈現(xiàn)，可實(shí)現(xiàn)特異性ECM的體外復(fù)制。生物打印仿生還可通過打印細(xì)胞或細(xì)胞聚集體，產(chǎn)生并沉積ECM，自發(fā)地構(gòu)建出適合細(xì)胞自身生長的微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)自身功能的發(fā)揮。SHABANI等[36]研究ECM成分的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)不同ECM混合材料對(duì)于NSCs神經(jīng)再生、存活、遷移以及分化等多種生物學(xué)功能均具有調(diào)控作用。LEE等[37]以膠原前體為細(xì)胞支架，通過3D生物打印技術(shù)將大鼠胚胎神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞打印在支架表面，以碳酸氫鈉溶液為霧化氣溶膠使膠原蛋白凝膠化，構(gòu)建單層或多層3D細(xì)胞-水凝膠復(fù)合材料，結(jié)果表明，大鼠胚胎神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長能力增強(qiáng)，且數(shù)量成比例增加。

3 神經(jīng)細(xì)胞3D模型應(yīng)用

神經(jīng)細(xì)胞3D模型可用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制以及治療方案的研究和藥物研發(fā)、篩選等多個(gè)方面。

3.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究

常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有帕金森綜合征、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等，這些疾病給患者及家屬帶來巨大痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故而近年來關(guān)于其發(fā)病機(jī)制、治療方案以及藥物開發(fā)等的研究發(fā)展迅速[38-40]。通過體外3D培養(yǎng)技術(shù)可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)、形態(tài)及其與周圍環(huán)境的關(guān)系等方面進(jìn)行詳細(xì)觀察。

CHEN等[41]采用熔融靜電紡絲法制備了高度有序的3D支架并對(duì)支架表面進(jìn)行修飾，研究不同表面修飾等離子體處理后的雙聚D-賴氨酸涂層和粘連蛋白涂層對(duì)PC12細(xì)胞(成年大白鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞系)生長的影響。結(jié)果表明經(jīng)等離子體處理后的雙聚D-賴氨酸涂層和粘連蛋白涂層修飾的支架最有效，可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞生長，為神經(jīng)損傷修復(fù)提供了一個(gè)多功能培養(yǎng)平臺(tái)。

WANG等[42]利用脫ECM水凝膠和甲基丙烯酸明膠組成的混合水凝膠體系進(jìn)行3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞負(fù)載生物打印，這種水凝膠技術(shù)可重現(xiàn)組織的功能性，避免了生物打印中擠壓方式對(duì)組織的破壞，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。MA等[43]制備了聚乙烯醇和海藻酸鈉復(fù)合水凝膠，在復(fù)合水凝膠中隨著聚乙烯醇比例的增高，水凝膠的孔徑和溶脹率增大，彈性模量減小。此外，與海藻酸鈉水凝膠相比，復(fù)合水凝膠與小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞(NPCs)還有良好生物相容性，提高了NPCs增殖能力，為構(gòu)建神經(jīng)組織工程和神經(jīng)疾病模型提供了合適支架。

3.2 藥物篩選

一般利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行候選藥物的安全性研究，體外實(shí)驗(yàn)可以檢測給藥后靶細(xì)胞的受損程度、毒副作用、安全性等。藥物的作用價(jià)值直接在靶細(xì)胞的損傷程度上體現(xiàn)出來，在檢測過程中，安全性實(shí)驗(yàn)可以體現(xiàn)候選藥物的毒副作用和其他不良反應(yīng)。在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，可觀察細(xì)胞形態(tài)、發(fā)育潛力及其與毗鄰組織的功能整合性，故而3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可應(yīng)用于藥物的篩選，且效率和安全性更高，結(jié)果更準(zhǔn)確[44-45]。

CHANG等[46]以3D類器官技術(shù)誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞(IPSCs)向神經(jīng)元細(xì)胞分化，用于大規(guī)模神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選和檢測。對(duì)阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓小腦萎縮等藥物的研發(fā)提供依據(jù)。GARCIA-LEON等[44]應(yīng)用人IPSCs產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞為阿爾茨海默病藥物篩選提供相關(guān)平臺(tái)。

4 展望

神經(jīng)細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)正處于快速發(fā)展的階段。神經(jīng)細(xì)胞3D培養(yǎng)技術(shù)為闡明神經(jīng)疾病的發(fā)病過程、機(jī)制以及特異性藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。但其仍存在一些缺陷：由于3D培養(yǎng)技術(shù)操作復(fù)雜，支架材料成本高，不能滿足大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)要求。此外，除了微流控芯片技術(shù)及3D生物打印技術(shù)，大部分3D培養(yǎng)技術(shù)無法模擬血管結(jié)構(gòu)，極大限制了神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育。因此，這些體外培養(yǎng)技術(shù)主要應(yīng)用于神經(jīng)疾病的早期表現(xiàn)、藥物活性篩選和機(jī)制研究，晚期病變及藥物研究大多仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)支持。相信不久的將來，神經(jīng)細(xì)胞3D培養(yǎng)技術(shù)會(huì)更加完善，這有利于進(jìn)一步替代傳統(tǒng)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也有利于更深入揭示人類神經(jīng)損傷和神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制和過程，為神經(jīng)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：關(guān)冀弛、陳艷閣、樊雪參與了研究設(shè)計(jì)；關(guān)冀弛、汪海峰、劉丹參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：The study was designed byGUANJichi,CHENYange, andFANXue.The manuscript was drafted and revised byGUANJichi,WANGHaifeng, andLIUDan.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.