李梅林 馬文錦 王 博 周彥兵 張永顯 于長青 彭 濤

(甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730000)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是指在應(yīng)用治療劑量的藥物時(shí)，由于藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝細(xì)胞毒性損傷，或肝臟對藥物及代謝產(chǎn)物的過敏反應(yīng)所致的疾病[1]。DILI約占所有藥物不良反應(yīng)的3.0%～9.0%，占肝炎患者的10%，隨著臨床藥物種類的不斷增加，DILI的發(fā)病率也隨之增多。DILI目前尚無特效療法，關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)、早停藥，并特異性地給予保肝解毒藥物，其治療基本原則是停止用藥、查明原因、對癥支持治療[2]。因此，重視和加強(qiáng)DILI的發(fā)生與防治尤為重要。

膠紅酵母(R.mucilaginosa)是酵母種屬的一種，為單細(xì)胞真核生物[3-4]。課題組前期通過形態(tài)學(xué)、碳源/氮源同化試驗(yàn)及18S rDNA生物學(xué)方法，鑒定菌株CM-1為膠紅酵母菌(R.mucilaginosa)。從R.mucilaginosaCM-1無機(jī)培養(yǎng)基中分離得到水溶性胞外多糖RmEPS，其產(chǎn)量為7.35 g/L，多糖RmEPS經(jīng)纖維素交換柱、凝膠滲透等純化方法可得到單一組分多糖RmEPS-11。文章擬通過研究膠紅酵母胞外多糖對小鼠藥物引起肝損傷的保護(hù)作用，分析其潛在的分子機(jī)制，為膠紅酵母胞外多糖在功能性食品與藥品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

昆明小鼠：體重16～24 g，雄性，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；

膠紅酵母(RhodotorulamucilaginosaCM-1)菌株：陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室；

抗壞血酸：分析純，河北鴻韜生物工程有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，北京百奧萊博科技有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，湖南韻邦生物醫(yī)藥有限公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)：分析純，上海基星生物科技有限公司；

異煙肼(INH)：生物試劑，西安利君制藥有限責(zé)任公司；

利福平(RIF)：生物試劑，鐘祥市耀威生物科技有限公司；

水飛薊素(Silymarin)：生物試劑，上海西寶生物科技股份有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒：上海朝瑞生物科技有限公司；

2,4-二硝基苯肼：分析純，成都聯(lián)禾化工醫(yī)藥有限責(zé)任公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)分析儀：HBS-1096A型，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：CT15RT型，上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市宏華儀器廠；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：M381409型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化活性 根據(jù)課題組[5]前期研究測定DPPH自由基、ABTS自由基和氧自由基清除能力，以及還原力。

1.2.2 對異煙肼和利福平肝毒性的保護(hù)作用 將雌雄小鼠隨機(jī)分為4組，雌雄各半，每組8只。小鼠飼養(yǎng)1周后，采用相同給藥方式，每天給藥1次，持續(xù)給藥7 d，其他飼養(yǎng)條件正常，最后1 d給藥后，禁食禁水12 h后進(jìn)行采樣處理。試驗(yàn)組：① 空白對照組：注射0.9% NaCl溶液(20 mL/kg 的0.9% NaCl注射液)；② INH模型對照組：灌胃給藥INH(以0.74 mmol/kg按0.2 mL/10 g體重)；③ RmEPS-11模型處理組：在INH模型組基礎(chǔ)上，注射RmEPS-11溶液(按100 mg/kg進(jìn)行肝保護(hù))和300 mg/kg RIF；④ 水飛薊素組：100 mg/kg 水飛薊素和300 mg/kg RIF體重灌胃。

1.2.3 臟器指數(shù)測定及樣品處理

(1)血樣處理和臟器指數(shù)測定：根據(jù)文獻(xiàn)[6-9]并修改。每只小鼠稱重后，摘取眼球取血，將血樣保存用于后期生物理化指標(biāo)測定，包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白質(zhì)總濃度(T-Protein)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等。脫臼處死小鼠，剖腹取出肝和腎，觀察其顏色及大小變化程度，稱重。取肝臟右葉部分組織，一部分凍存用于測定生物指標(biāo)，一部分樣品用錫箔紙包好放入無RNAase的EP管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱用于后期分子學(xué)試驗(yàn)；另一部分用10%福爾馬林固定后，用于后續(xù)光鏡下檢驗(yàn)其病理學(xué)變化。

(2)肝勻漿制備：將保存的部分肝臟用生理鹽水清洗，精確稱重，剪碎，與生理鹽水混勻制備肝勻漿組織[10]，離心，上清液于4 ℃保存。

(3)ALT/GPT的測定：按照試劑盒要求測定。

(4)AST/GOT的測定：按照試劑盒要求測定。

1.2.4 T-Protein測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.5 SOD測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.6 MDA測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.7 GSH-PX測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.8 病理學(xué)研究 經(jīng)HE染色劑染色后[11]，光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)變化。正常：肝組織結(jié)構(gòu)相對正常，無變性等；1級：小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞略有脂肪變性，伴有輕度壞死；2級：變性程度加重，肝小葉可見明顯壞死；3級(+++)：肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見明顯的大片狀壞死病灶。

1.2.9 相關(guān)基因CYP2E1及表達(dá) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對其相關(guān)基因CYP2E進(jìn)行定量表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參基因，將-80 ℃凍存的小鼠肝臟在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行CYP2E1和CYP1A2的差異研究。

1.2.10 總RNA的提取純化 根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]并修改。

(1)破碎勻漿：將樣品分別從-80 ℃冰箱中取出，加入液氮用研缽反復(fù)研磨成粉末狀，并于凍融前研碎，轉(zhuǎn)至加入RNAiso Plus的裂解液中，振蕩混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

(2)提?。簩⒙确录又羷驖{裂解液中，振蕩混勻，靜置。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，靜置，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

(3)RNA沉淀的清洗和溶解：向沉淀中加入乙醇溶液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，除去乙醇，添加一定量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

(4)熒光實(shí)時(shí)定量PCR：按照試劑盒說明加樣，在普通PCR的退火溫度附近選擇幾個(gè)溫度，用同一樣品，得到Ct值最小的為最佳溫度。

(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 由圖1(a)可知，DPPH自由基清除活性隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，RmEPS-11和維生素C的清除率分別為66.15%，97.62%。RmEPS-11的IC50值為2.96 mg/mL。綜上，RmEPS-11具有較高的DPPH自由基清除能力，提示RmEPS-11可以將電子或氫供給DPPH自由基。

2.1.2 ABTS自由基清除能力 由圖1(b)可知，RmEPS-11對ABTS自由基的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，RmEPS-11和維生素C的清除率分別為82.80%，99.57%，說明RmEPS-11表現(xiàn)出一定的ABTS自由基清除活性。

2.1.3 還原力 由圖1(c)可知，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL 時(shí)，還原能力隨樣品濃度的增加而增大，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，還原力高達(dá)0.753。

2.1.4 氧自由基清除能力(ORAC值) 經(jīng)計(jì)算，RmEPS-11的ORAC值為(560.38±6.45)μmol TE/g。由圖1(d)可知，RmEPS-11具有強(qiáng)的氧自由基清除能力，主要因?yàn)槎嗵堑臍湓迂暙I(xiàn)給了環(huán)上的C—H鍵或醛糖、糖醛酸上的O—H和其他位點(diǎn)來清除自由基。

圖1 多糖RmEPS-11和抗壞血酸的抗氧化活性Figure 1 Free radical scavenging and reducing power activities of ascorbic acid and RmEPS-11

2.2 肝功能活性分析

由表1可知，通過異煙肼和利福平處理后AST和ALT含量顯著提高(P<0.01)，表明其增大了肝臟的氧化應(yīng)激。與空白對照組相比，模型組AST和ALT含量顯著升高(P<0.01)。陽性對照組和RmEPS-11治療組與INH模型對照組相比，AST、ALT含量顯著降低(P<0.01)，因此AST、ALT可作為異煙肼和利福平肝毒性的評估指標(biāo)。MDA、SOD和GSH含量也有類似變化。異煙肼和利福平處理后，試驗(yàn)鼠體內(nèi)MDA含量升高，SOD和GSH含量降低(P<0.01)，與空白對照組相比，表明脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致異煙肼和利福平中毒。陽性對照組和RmEPS-11治療組與INH模型對照組相比，能降低MDA含量、調(diào)高SOD和GSH含量，最終接近模型組(P<0.01)，表明RmEPS-11在逆轉(zhuǎn)肝損傷過程中起到一定作用。

表1 通過RmEPS-11治療后血清中ALT、AST、SOD、MDA、GSH含量?Table 1 Effects of RmEPS-11 on serum ALT,AST levels and hepatic SOD activity,MDA and GSH content in rats

由圖2可知，對照組的小鼠肝臟病理切片顯示正常組織形態(tài)；用異煙肼和利福平處理的試驗(yàn)鼠呈現(xiàn)肝硬化、經(jīng)典的組織凝固性壞死、大量纖維化、單核細(xì)胞浸潤、出血、脂肪變性和再生結(jié)節(jié)的形成。RmEPS-11治療組和陽性對照組中未發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)變化。綜上，RmEPS-11能夠治療和改善異煙肼和利福平引起的肝損傷。

圖2 小鼠肝組織的病理切片F(xiàn)igure 2 Histological examination of liver tissue sections stained with HE(×400)

2.3 CYP2E1的表達(dá)

由圖3可知，CYP2E1在INH模型組中的表達(dá)量(1.90±0.42)與空白組(0.98±0.26)相比極顯著升高(P<0.01)，但SC陽性對照組(0.75±0.19)和RmEPS-11治療組(0.82±0.22)與INH模型組差異顯著(P<0.05)，CYP2E1表達(dá)量明顯降低。

異煙肼(INH)和利福平(RIF)是用于抗結(jié)核化療的一線藥物，具有潛在的肝毒性，可能導(dǎo)致藥物引起的肝損傷，如果這種肝毒性不能及早識別，后果是致命的，且引起肝毒性的發(fā)病機(jī)制是多方面的[16-17]。一些研究[18-20]表明，CYP2E1參與INH和RIF肝毒性的形成過程，可能是細(xì)胞內(nèi)過多自由基或毒性代謝產(chǎn)物堆積，造成氧化應(yīng)激引起肝毒性，而抗氧化劑可以保護(hù)細(xì)胞和組織免受各種疾病中活性氧和其他自由基的有害影響。

1.空白對照組 2.模型組 3.陽性對照組 4.RmEPS-11治療組圖3 CYP2E1 mRNA的表達(dá)Figure 3 The CYP2E1 mRNA expression in all groups

3 結(jié)論

在多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上評估了RmEPS-11對小鼠異煙肼和利福平引起的肝臟毒性的影響。結(jié)果顯示，與異煙肼和利福平處理的小鼠相比，RmEPS-11給藥后血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平和肝臟丙二醛含量顯著降低，肝臟超氧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶含量顯著恢復(fù)。此外，肝臟的組織病理學(xué)損傷和凋亡肝細(xì)胞數(shù)量改善顯著。機(jī)制研究表明，保護(hù)作用主要是由于CYP2E1mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致有害自由基和ROS的形成減少，同時(shí)抗氧化能力提高，多糖RmEPS-11通過抑制肝CYP2E1抑制脂質(zhì)過氧化，增加自由基的清除。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)應(yīng)開展膠紅酵母胞外多糖的急毒研究，研究半數(shù)致死量或最大耐受量，為其后期的開發(fā)利用提供安全依據(jù)。