張玲瑜 苗建銀 曹 愚 戴偉杰 劉 果 李振偉 曹 庸

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 廣東惠爾泰生物科技有限公司，廣東 廣州 511356；3. 河源綠純食品有限公司，廣東 河源 517000)

高血壓是一種心血管疾病，臨床癥狀表現(xiàn)為血壓升高，伴隨頭暈、頭痛等[1]。隨著人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速，高血壓發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，目前中國高血壓患者約2.45億人[2]，高血壓的防治已成為備受關(guān)注的問題。神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin I-converting Enzyme,ACE)是一類鋅蛋白酶，主要存在于肺部毛細(xì)血管和腎臟上皮細(xì)胞，在腎素—血管緊張素系統(tǒng)中，ACE可以將血管緊張素Ⅰ裂解為可引起血管收縮的血管緊張素Ⅱ，進(jìn)而引起高血壓[3-5]。因此，研究中常用抑制ACE的手段達(dá)到降血壓的效果。

市面上常見的降壓藥如卡托普利、賴諾普利等化學(xué)合成類物質(zhì)，雖具有明顯的降壓效果，但服用會伴隨一些副作用，如咳嗽、皮膚過敏、味覺紊亂等[6]。食源性生物活性肽來源廣泛，安全性高，是化學(xué)合成藥品的理想替代物，而目前有大量研究表明具有ACE抑制活性的食源性生物活性肽有顯著的降血壓功效，如南瓜籽肽[7]、大米肽[8]、芝麻籽肽[9]、香菇蛋白肽[10]等。

中國水稻產(chǎn)量豐富，稻谷年均總產(chǎn)量達(dá)2億t以上，但稻米加工仍處于初加工狀態(tài)，有效利用率只有60%～65%，大量米糠等資源未得到有效開發(fā)[11]。米糠是稻谷脫殼后精碾大米的副產(chǎn)物，稻米在加工為食用大米時約產(chǎn)生10%的米糠，而這些米糠含有的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎占整個稻米的65%[12]。米糠中含有約12%～20%的蛋白質(zhì)，氨基酸含量十分豐富[13]，米糠蛋白經(jīng)水解后可獲得多種生物活性肽，如阿片拮抗肽[14]、抗氧化肽[15]、免疫功能調(diào)節(jié)肽[16]等。目前關(guān)于米糠蛋白ACE抑制肽的研究報道較少，且在酶解工藝上多采用堿性蛋白酶[17-18]，而過高的pH在實際生產(chǎn)中易對工廠設(shè)備造成腐蝕損耗且后續(xù)加工增加了脫鹽環(huán)節(jié)。此外酶添加量、酶解時間、溫度等因素的選擇都會對實際生產(chǎn)的能耗產(chǎn)生影響，因此尋求經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的生產(chǎn)工藝值得深入探討。

試驗擬以ACE抑制率為指標(biāo)，從酶種類、pH、酶添加量、底物質(zhì)量濃度、酶解溫度等方面進(jìn)行酶解工藝的優(yōu)化以獲取ACE抑制肽制備的最優(yōu)工藝條件，并檢測其氨基酸組成，通過超濾進(jìn)行初步分離，以期為進(jìn)一步對ACE抑制肽進(jìn)行分離純化和研究其ACE抑制機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米糠：由實驗室自制；

胃蛋白酶：3.0×103NF·U/mg，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

木瓜蛋白酶：2.0×105U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：2.5×105U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

中性蛋白酶：5 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE，來源于兔肺)：美國Sigma公司；

氫氧化鈉：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

鹽酸：分析純，河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

pH計：PHS-3CW型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市華城海龍實驗儀器廠；

電子天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：2300型，美國Perkin Elmer公司；

臺式低速離心機(jī)：L530型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-C型，常州澳華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠蛋白酶解物制備 稱取一定量的米糠蛋白粉，用蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH至合適范圍，將樣品放入水浴鍋，待樣液溫度達(dá)到設(shè)定溫度后添加一定比例蛋白酶，水浴酶解3 h，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心20 min，取上清液，即為米糠蛋白酶解物。

1.2.2 ACE抑制率測定 參照駱琳等[19]的方法，修改如下：用96孔板，在樣品孔中分別添加40 μL的樣液、50 μL的呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)和10 μL的ACE酶；在空白孔中分別加入40 μL的HEPES緩沖溶液、50 μL的FAPGG和10 μL的ACE酶，使用酶標(biāo)儀檢測其340 nm處的吸光值并記錄，在37 ℃下恒溫保存30 min后再檢測一次其在340 nm處的吸光值并記錄，按式(1)計算ACE抑制率。

(1)

式中：

R——ACE抑制率，%；

a1——空白孔340 nm處的初始吸光度；

a2——37 ℃保溫30 min后空白孔340 nm處的吸光度；

b1——樣品孔340 nm處的初始吸光度；

b2——37 ℃保溫30 min后樣品孔340 nm處的吸光度。

1.2.3 最優(yōu)酶的篩選 選取胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，底物質(zhì)量濃度為4 g/100 mL蒸餾水，酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解3 h，以及各自最適pH和溫度條件下制備米糠蛋白酶解物，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最優(yōu)蛋白酶。

1.2.4 單因素試驗

(1)pH對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL底物質(zhì)量濃度混合均勻，在pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳pH條件。

(2)酶解溫度對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL底物質(zhì)量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶分別在35，40，45，50，55 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳酶解溫度條件。

(3)底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水分別按2，4，6，8，10 g/100 mL的底物質(zhì)量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳底物質(zhì)量濃度條件。

(4)酶添加量對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL的底物質(zhì)量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳酶添加量條件。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取pH、底物質(zhì)量濃度和酶解溫度3個因素，根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，以米糠蛋白ACE抑制率為響應(yīng)變量進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝。

1.2.6 酶解物和超濾組分ACE抑制活性評價 將最佳工藝條件下制備的酶解液通過超濾將其分成分子量>3 kDa 和<3 kDa兩部分，隨后將最優(yōu)酶解物和超濾組分冷凍干燥至粉末，在0.5，1.0 mg/mL兩個質(zhì)量濃度下分別計算其ACE抑制率。

1.2.7 氨基酸組分測定 參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的外標(biāo)法，酸水解后測定酶解物中氨基酸的組成及其含量，在此測定中色氨酸被完全破壞。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 部分?jǐn)?shù)據(jù)圖采用Origin 8.6進(jìn)行繪制。采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗的設(shè)計與分析，采用SPSS Statistics 21軟件以單因素ANOVA法和Duncan法分析數(shù)據(jù)間差異，P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

天然食源性蛋白質(zhì)經(jīng)體外酶解或體內(nèi)消化后，能產(chǎn)生具有特殊生理功能的肽段，而不同的蛋白酶因具有不同酶切位點，即使使用同種蛋白質(zhì)原料，酶解后產(chǎn)生的肽段活性也存在差異[20]。如圖1所示，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物顯示出最高的ACE抑制活性，ACE抑制率為(67.39±2.78)%，明顯優(yōu)于其他3種蛋白酶(P<0.05)。因此，后續(xù)試驗均使用中性蛋白酶對米糠蛋白進(jìn)行酶解。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖1 蛋白酶種類對ACE抑制率的影響Figure 1 The effect of protease types on ACE inhibition rate

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響 由圖2 可知，pH為7.0時，酶解物顯示最好ACE抑制率，明顯優(yōu)于當(dāng)pH為5.5，6.0，6.5時的(P<0.05)。這可能是pH偏離中性時中性蛋白酶的活性受到抑制，活性基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結(jié)合能力降低從而導(dǎo)致酶解效果不佳[21]，所以最佳pH為7.0。

2.2.2 底物質(zhì)量濃度對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響 由圖3可知，底物質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)變化較為明顯，在到達(dá)4 g/100 mL的質(zhì)量濃度后，雖有正增長，但變化緩慢，在8 g/100 mL的底物質(zhì)量濃度條件下有最大ACE抑制率為(69.70±2.79)%，但與10 g/100 mL的底物質(zhì)量濃度條件下ACE抑制率差異并不顯著，可能是因為在此酶添加量下，底物已達(dá)到飽和，所以即使再加大底物質(zhì)量濃度也不會再提高酶解液的ACE抑制率。所以，確定最佳底物質(zhì)量濃度條件為8 g/100 mL。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖3 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響Figure 3 The effect of mass concentration of substrate on ACE inhibition rate

2.2.3 酶解溫度對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響

由圖4可知，當(dāng)酶解溫度條件設(shè)置為45 ℃時，有最好的ACE抑制率(64.35±1.25)%，此結(jié)果明顯優(yōu)于其他溫度下的(P<0.05)。中性蛋白酶最適宜的溫度條件是45 ℃，溫度在一定范圍內(nèi)升高，促進(jìn)分子運(yùn)動的加快，酶與底物的碰撞幾率增大，從而提高酶的活性，得以釋放更多肽段[22]。但是過高的溫度又會一定程度上破壞酶的結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致酶的活力受到影響甚至失活。所以選取的最佳酶解溫度條件為45 ℃。

字母不同表示在P<0.05水存在顯著性差異圖4 酶解溫度對ACE抑制率的影響Figure 4 The effect of enzymatic temperature on ACE inhibition rate

2.2.4 酶添加量對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響

如圖5所示，酶添加量與ACE抑制率在0.1～0.3 g/100 g 米糠蛋白濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系，在酶到達(dá)0.3 g/100 g米糠蛋白的添加量后，基本不再變化，有最大ACE抑制率為(68.73±2.11)%，此時再加大酶添加量，ACE抑制率變化并不顯著，可能是因為在底物一定的情況下，酶添加量已達(dá)到飽和。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，確定最佳酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖5 酶添加量對ACE抑制率的影響Figure 5 The effect of the enzyme addition on ACE inhibition rate

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選定酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白，以pH、底物質(zhì)量濃度和酶解溫度3個因素(見表1)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計表Table 1 Response surface factor level design

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and experimental results

運(yùn)用Design-Expert 8.0對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到ACE抑制率對于pH、底物質(zhì)量濃度和酶解溫度的二次回歸方程為：

Y=72.08+4.02A+3.20B+2.02C-0.065AB+2.31AC-0.35BC-4.06A2-1.47B2-3.72C2。

(2)

根據(jù)方差分析(表3)，回歸模型高度顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.01)，表明此模型比較穩(wěn)定和理想。決定系數(shù)R2=0.964 2，表明模型與實際試驗擬合較好。因素A、B、C的一次項均顯著(P<0.01)，說明pH、底物質(zhì)量濃度和酶解溫度均對酶解產(chǎn)生顯著的影響。交互項AB、AC、BC均不顯著，說明任意兩因素間交互作用不顯著，兩個因素間的交互作用詳見圖6。比較表3各因素的F值，可以得知3個因素對酶解液ACE抑制率的影響作用大小順序為：pH>底物質(zhì)量濃度>酶解溫度。

圖6 pH、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度交互作用對ACE抑制率的影響Figure 6 The influence of the interaction of pH,enzymatic hydrolysis temperature,and substrate mass concentration on the inhibition rate of ACE

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression model

根據(jù)模型預(yù)測，在pH 7.23，底物質(zhì)量濃度8.22 g/100 mL，酶解溫度46.43 ℃時有最好的ACE抑制率73.96%，按實際情況將工藝調(diào)整為pH為7.2，底物質(zhì)量濃度為8.2 g/100 mL，酶解溫度為46 ℃，酶解3 h后測其ACE抑制率為(74.63±1.01)%，結(jié)果符合模型預(yù)測，證明此模型與實際情況較為相符。因此，米糠蛋白源ACE抑制肽的酶解制備最優(yōu)工藝為：pH 7.2，底物質(zhì)量濃度8.2 g/100 mL，酶解溫度46 ℃，酶添加量0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解時間3 h。

2.4 酶解物和超濾組分ACE抑制活性評價

利用3 kDa超濾膜超濾分離酶解物，冷凍干燥后測定酶解物和不同超濾組分在同一濃度條件下的ACE抑制率，同時與降血壓藥物卡托普利、馬來酸依那普利進(jìn)行陽性對照，結(jié)果如圖7所示。在1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度下，陽性藥物卡托普利和馬來酸依那普利有最好的ACE抑制活性，其他組分都表現(xiàn)出顯著的ACE抑制活性，分子量<3 kDa組分的ACE抑制率[(81.68±1.08)%]顯著優(yōu)于酶解物[(72.64±1.61)%]和分子量>3 kDa組分的[(58.65±2.31)%]。Yu等[23]將魚膠原蛋白酶解物超濾分成4個不同分子量大小的組分，結(jié)果表明最小分子量組分有最好的ACE抑制率；Yang等[24]將阿拉斯加鱈魚皮蛋白酶解物分成分子量>10，3～10，<3 kDa的組分，其中<3 kDa組分有最好的ACE抑制率。說明分子量大小與ACE抑制率有顯著的聯(lián)系，分子量越小，其ACE抑制率越高。

2.5 氨基酸組成分析

由表4可知，米糠蛋白酶解物中有16種氨基酸，包含除色氨酸外的7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其中谷氨酸含量最高(11.88 g/100 g)，占氨基酸總量的18.75%，其次是精氨酸(5.62 g/100 g)和亮氨酸(5.14 g/100 g)。

表4 米糠蛋白酶解物中的氨基酸含量?Table 4 Amino acid content in rice bran enzymatic hydrolysate

必需氨基酸總含量為22.82 g/100 g，占氨基酸總量的36.01%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白模式[25]。同時，酶解物中疏水性氨基酸含量豐富，約為23.09 g/100 g。研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，氨基酸C端疏水性和正電荷正向影響肽的ACE抑制活性，這是因為肽的C端氨基酸有助于抑制劑在ACE活性位點的結(jié)合，ACE抑制活性依賴疏水性氨基酸，所鑒定的疏水氨基酸含量較高的ACE抑制肽通常比疏水氨基酸含量較低的ACE抑制肽活性更高。說明米糠是提取ACE抑制肽的理想原料，有很好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

以米糠蛋白為原料，以神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝。用4種不同的蛋白酶對其進(jìn)行酶解，選取中性蛋白酶進(jìn)行單因素以及響應(yīng)面試驗，最佳酶解工藝參數(shù)為：pH 7.2，底物質(zhì)量濃度8.2 g/100 mL，酶解溫度46 ℃，酶添加量0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解時間3 h，此工藝參數(shù)反應(yīng)條件溫和，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)較為經(jīng)濟(jì)友好。在此條件下制備獲得的酶解物的神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率為(74.63±1.01)%，有顯著的ACE抑制活性。酶解物超濾后通過活性分析表明分子量大小顯著影響其神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性。氨基酸分析顯示米糠蛋白酶解物有22.82 g/100 g的必需氨基酸和23.09 g/100 g的疏水性氨基酸，與前人[26-27]認(rèn)為神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性與疏水性氨基酸有關(guān)的研究一致。試驗僅限于體外的神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制功效，后續(xù)將繼續(xù)對酶解物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以得到單體肽段，并深入探究其抑制神經(jīng)緊張素轉(zhuǎn)換酶的具體機(jī)制。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖7 不同組分在同一質(zhì)量濃度(1 mg/mL)下的ACE抑制率Figure 7 ACE inhibition rate of different components at the samemass concentrations (1 mg/mL)