王梓諾 王耀華 劉家棟 陸 震 趙 毅 莊 潔 溫亮亮

華熙生物科技股份有限公司上海研發(fā)中心，上海，200120

皮膚微生態(tài)指的是由皮膚表面的宿主細胞及分泌物、各類微生物，以及所處的微環(huán)境組成的生態(tài)系統(tǒng)，它們共同維持著皮膚平衡[1-3]。人體皮膚表面微生物種類繁多，按照在皮膚上存在時間的長短進行分類，可以將這些微生物分為常駐菌群和暫駐菌群[4]，皮膚表面常見的常駐菌有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、丙酸桿菌屬、微球菌屬、馬拉色菌屬[5]等。此外，皮膚表面生存的益生菌有利于調(diào)理皮膚，維持皮膚微生態(tài)平衡，代表的益生菌有乳酸桿菌和雙歧桿菌[6]等，不少化妝品中都會添加益生菌發(fā)酵液來保護皮膚屏障，已經(jīng)有文章證實，乳酸桿菌發(fā)酵液可以顯著清除自由基,促進Nrf-2蛋白的活化，激發(fā)皮膚細胞的抗氧化活力[7]，因此將乳酸桿菌等益生菌的發(fā)酵液利用到化妝品當中具有廣闊前景。

科研人員熱衷于探究皮膚微生態(tài)的規(guī)律，但是由于皮膚表面微生物種類復(fù)雜繁多，僅僅依靠傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法已無法進行深入探究。高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）由于其高通量、測序快、準確度高的優(yōu)點，為皮膚表面微生物檢測帶來了新的希望，現(xiàn)已應(yīng)用在微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、遺傳病的診斷、植入前遺傳學(xué)檢測等多個領(lǐng)域[8-10]。按照其測序覆蓋范圍大小可分為：全基因組測序、全外顯子組測序、靶向目標基因測序[11,12]。盡管高通量測序已經(jīng)有了一定的發(fā)展，但是在化妝品皮膚微生態(tài)領(lǐng)域，其應(yīng)用仍然存在很多不足。基于以上，本實驗利用高通量測序技術(shù)，對使用乳酸桿菌發(fā)酵液前后的臉部皮膚微生態(tài)進行分析比較，并結(jié)合生物信息學(xué)知識，對臉部皮膚菌群進行揭示，為證明高通量測序能夠有效分析皮膚微生態(tài)提供實驗支持。

1 實驗部分

1.1 實驗流程

1.1.1 志愿者選擇

召集10位實驗志愿者，年齡25～35歲，性別比例隨機，受試部位無痤瘡、皮炎、濕疹等皮膚病變。要求志愿者每天早、晚各一次全臉涂抹5%乳酸桿菌發(fā)酵液水溶液，并在采樣前12 h避免清洗采樣皮膚部位。

1.1.2 采樣過程

將一次性無菌采樣拭子用無菌生理鹽水潤濕后觸及采樣區(qū)域，保持拭子的軸平行于皮膚表面，并施加穩(wěn)定的壓力,在約3 cm2的區(qū)域內(nèi)沿垂直方向擦拭皮膚表面10次。按上述方法分別采集額頭、鼻翼和臉頰上的皮膚樣品，在該乳酸桿菌發(fā)酵液使用前（即第0天）、使用后第7天、第14天分別取樣，總計3次；每次固定在額頭、鼻翼、臉頰3個部位取樣，采樣后凍存于-70℃待進行微生物基因組DNA提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA抽提

提取全基因組DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增

按指定測序區(qū)域（16s v3v4區(qū)），合成帶有5’ barcode的特異引物。全部樣品按照正式實驗條件進行PCR擴增，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行膠回收符合目的的PCR產(chǎn)物。

1.2.3 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR膠回收產(chǎn)物用Qubit進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。

1.2.4 文庫的建立及Miseq上機測序

使用TruSeq DNA HT Sample Prep Kit，MiSeq Reagent Kit v3構(gòu)建擴增子文庫，最后在Illumina Hiseq 2500測序平臺上測序。

1.2.5 生物信息分析與數(shù)據(jù)處理

利用qiime2軟件中dada2包對測序數(shù)據(jù)的Read1和Read2進行拼接，形成feature表，基于feature聚類分析結(jié)果，對feature進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測。

使用Uparse軟件將序列同源性≥97%的有效序列聚類為同一OTUs；細菌對Observedspecies和Shannon指數(shù)進行正態(tài)分布檢驗后，用SPSS16.0軟件計算各組內(nèi)的均數(shù)±標準差；運用T檢驗檢測組間的α多樣性差異有無統(tǒng)計學(xué)意義；對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，應(yīng)用Mothur軟件(V1.33.3)計算分子方差分析(Anova)，評估組間群落結(jié)構(gòu)差異有無統(tǒng)計學(xué)意義；應(yīng)用T檢驗確定兩組間相對豐度存在差異的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性

圖1分別為不同組的α多樣性指數(shù)的比較箱線圖，并給出了不同組之間的差異P值。

圖1 第0d、7d、14d取樣的α多樣性指數(shù)箱線圖 A.Chao1指數(shù)；B.觀察種數(shù)；C.Shannon指數(shù)；D.Simpson指數(shù)。

多樣性結(jié)果顯示，在使用該乳酸發(fā)酵液的第0天、第7天、第14天，皮膚表面菌群種類具有顯著性差異（P＜0.05），且與使用前相比，Shannon指數(shù)和Simpon指數(shù)隨著使用時間的增加呈現(xiàn)了一定程度的下降趨勢；Chao1指數(shù)和Observed指數(shù)在第7天呈現(xiàn)較為明顯的降低，在第14天又有了一定的回升趨勢，但整體來說第14天時Chao1指數(shù)和Observed指數(shù)降低，由此分析，使用該乳酸發(fā)酵液14d降低了皮膚表面菌群多樣性。

2.2 β多樣性分析

使用化妝品后皮膚菌群的β多樣性分析見圖2。

由圖2可知，隨著乳酸桿菌發(fā)酵液使用時間的延長（7～14 d），使用相同天數(shù)的樣品能夠明顯聚類，且與0天樣品能顯著區(qū)分開，表明乳酸桿菌發(fā)酵液的使用對面部皮膚菌群組成產(chǎn)生了顯著的影響。

圖2 使用化妝品后皮膚菌群的β多樣性分析 A.于jaccard算法；B.基于未加權(quán)UniFrac距離；C.基于NMDS算法；D.PCA分析

2.3 物種組成分類情況

2.3.1 門水平的群落結(jié)構(gòu)

面部皮膚菌群門水平組成見圖3。

圖3 面部皮膚菌群組成（門水平）

在門水平，無論是使用前還是使用后，雖然有豐度上增加或減少的差別，但是整體來講都是變形菌門（p-Proteobacteria）、放線菌門（p-Actinobacteria）、厚壁菌門（p-Firmicutes）、擬桿菌門（p-Bacteroide）所占比例最大，說明面部皮膚上變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢菌。相對于使用前，使用14d的結(jié)果顯示放線菌門豐富度增加；厚壁菌門豐富度先增加，后有減少趨勢，但與0d相比，其相對豐度還是呈現(xiàn)增加趨勢；變形菌門豐度減少；擬桿菌門豐度減少；疣微菌門（p-Verrucomicrobia）豐度減少（P＜0.05）。由于變形菌門中包括很多病原菌，如大腸埃希菌、沙門菌、霍亂弧菌等，它們的減少在一定程度來說有可能降低對于皮膚健康的威脅，同樣地，擬桿菌綱的很多種類生活在人體腸道中，在某些情況下會成為致病菌，對于皮膚而言其豐度降低也是有益的。因此，在一定程度上說明使用該乳酸桿菌發(fā)酵液有益于皮膚微生態(tài)。

2.3.2 屬水平的菌落結(jié)構(gòu)

面部皮膚菌群屬水平組成見圖4。

圖4 面部皮膚菌群組成（屬水平，相對豐度前20）

結(jié)合單變量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，使用14d后，在屬水平上，面部皮膚菌群中乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等的相對豐度增加，別樣桿菌屬（Alistipes）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、腸球菌屬（Enterococcus）和銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas）等的相對豐度減少。

3 結(jié)論

高通量測序技術(shù)的發(fā)展使人們對于皮膚微生態(tài)有了更加深入的認知，通過高通量測序，能夠?qū)ζつw表面的菌群從門、屬等水平進行分類，同時能夠借助生物信息學(xué)分析皮膚表面微生物群落的多樣性及不同群落之間的多樣性，這為認識復(fù)雜龐大的皮膚微生態(tài)提供了有力的支持。

在本實驗中，讓10名志愿者涂抹乳酸桿菌發(fā)酵液，并分別在使用乳酸桿菌發(fā)酵液之前第0天，之后第7天、第14天進行取樣測序，測序結(jié)果說明使用乳酸桿菌發(fā)酵液對面部皮膚菌群組成產(chǎn)生了顯著的影響。本次實驗由于人員、時間等的限制，僅進行到第14天，而第14天的Chao1指數(shù)和Observed有了一定的回升，故不排除一部分菌群對乳酸桿菌發(fā)酵液產(chǎn)生了耐受性，后續(xù)多樣性有繼續(xù)上升的可能，這有待于進一步論證；人體面部皮膚以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢菌種；門水平的結(jié)果還提示使用乳酸桿菌發(fā)酵液后，可能在一定程度增加皮膚常駐菌的豐度，降低大腸埃希菌、霍亂弧菌等致病菌的豐度；屬水平的結(jié)果顯示，使用該乳酸桿菌發(fā)酵液能夠增加面部皮膚中乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等的相對豐度，減少別樣桿菌屬（Alistipes）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、腸球菌屬（Enterococcus）和綠膿桿菌屬（Pseudomonas）等的相對豐度，皮膚表面常駐菌—葡萄球菌屬、益生菌—雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的增加在一定程度上反映了使用該乳酸發(fā)酵液可能有利于皮膚微生態(tài)。

不難發(fā)現(xiàn)，利用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，能夠檢測出使用相關(guān)化妝品前后皮膚表面微生態(tài)的變化，有利于對皮膚微生態(tài)進行深入分析，能夠為化妝品在皮膚微生態(tài)方面的發(fā)展提供科學(xué)指導(dǎo)。