智麗飛 張二壯 王秀文 石秀芳

1.太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原，030024；2.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西太原，030619

自從2020年初新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，人們對日常消毒殺菌的意識提高到了前所未有的高度，最近兩年消殺產(chǎn)品的需求量和生產(chǎn)量快速增長，其中一類無色、無味、使用安全、不易揮發(fā)、不易燃的廣譜高效季銨鹽殺菌劑[1]，與常用的酒精、過氧乙酸、有機醛、二氧化氯、84消毒液等殺菌劑相比，不論在運輸、存儲和使用安全等方面[2,3]，還是應用功能方面（防腐蝕、抗靜電、洗滌、柔軟、吸附、絮凝等）[4]都更具有優(yōu)勢。因此，季銨鹽表面活性劑最近兩年在研究領(lǐng)域和生產(chǎn)方面都快速增長。但目前常用的季銨鹽大多數(shù)細胞毒性較大，開發(fā)低毒、多功能的生物基季銨鹽表面活性劑迫在眉睫。糖類物質(zhì)由天然可再生資源淀粉制備而來，是生物質(zhì)原料的典型代表[5]，課題組以葡萄糖酸內(nèi)酯或乳糖酸為原料開發(fā)了系列糖基季銨鹽表面活性劑[6-8]，其中N,N-二甲基-N[3-(乳糖酰胺基)]丙基-N-烷基溴化銨（C12DLPB）產(chǎn)品（結(jié)構(gòu)式見式1）[9]具有無刺激、毒性低、與陰離子有較好的復配性能、對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有較高的抑菌活性[10]。季銨鹽表面活性劑可以與蛋白質(zhì)相結(jié)合[11]，且蛋白質(zhì)與表面活性劑混合體系在生物技術(shù)過程、藥物輸送、化妝品系統(tǒng)、洗滌劑、食品和生物科學中具有廣泛而重要的應用[12]。牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白（HSA）極為相似，且在水介質(zhì)中有較好的穩(wěn)定性和溶解性，因此BSA作為模型蛋白被廣泛應用于研究蛋白質(zhì)和兩親配體的相互作用[13,14]。研究C12DLPB與BSA的相互作用，能更好地了解其殺菌機制，且為開發(fā)其在洗滌劑、化妝品、生物科學和藥物傳輸?shù)确矫娴膽锰峁├碚撘罁?jù)。

本文采用熒光光譜法研究了C12DLPB與BSA相互作用的適宜條件；通過動態(tài)猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學參數(shù)的計算，了解二者相互結(jié)合的作用；并通過三維熒光光譜考察了BSA在C12DLPB作用下的構(gòu)象變化。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

C12DLPB，課題組自制，純度＞98%；牛血清白蛋白（BSA）和氯化鈉（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，生物技術(shù)級96%；實驗用水為娃哈哈純凈水。

F97pro熒光分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-4C+智能酸度計，成都世紀方舟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜

準確移取BSA儲備液（1×10-4mol/L）1.0ml于10 ml容量瓶中，然后依次加入不同體積的C12DLPB儲備液（2×10-3mol/L），定容至刻度。

激發(fā)狹縫寬度10 nm，發(fā)射狹縫寬度5 nm，激發(fā)波長283 nm，掃描速度1000轉(zhuǎn)/min，掃描間隔1 nm。

1.2.2 三維熒光光譜

激發(fā)波長200～500 nm，發(fā)射光波長200～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm，激發(fā)光波長掃描間隔5 nm，掃描間隔1 nm，掃描速度1 000 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

熒光發(fā)射光譜能精確地反映蛋白質(zhì)發(fā)射熒光基團周圍環(huán)境的構(gòu)象和疏水性等的變化[15]。BSA屬于內(nèi)源性熒光物質(zhì)，分子中含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能發(fā)射熒光。隨著C12DLPB溶液濃度的增加（圖1），BSA的內(nèi)源性熒光強度降低，并發(fā)生了藍移；熒光強度由408AU降低到了338AU，降低了17%；熒光峰由341 nm藍移到了336 nm，表明C12DLPB引起B(yǎng)SA表面3個氨基酸殘基周圍的構(gòu)象及疏水性能發(fā)生變化，因此BSA熒光發(fā)生了猝滅。當C12DLPB濃度為0.2×10-4mol/L時，熒光猝滅現(xiàn)象較強，說明此濃度下C12DLPB與BSA結(jié)合作用較強，因此選擇該濃度為作用濃度。

圖1 不同濃度C12DLPB對BSA熒光強度的影響

2.2 作用時間

由圖2可以看出，在0 min時，C12DLPB-BSA的熒光強度大大降低，從448AU降低到了441AU。在15～60 min作用時間內(nèi)，BSA與C12DLPB-BSA熒光強度變化比較平穩(wěn)，之后熒光強度又有所升高，變化較大，相對不穩(wěn)定?？傮w來看，15～35 min熒光強度變化趨于穩(wěn)定，因此選擇15 min為最佳的作用時間。

圖2 不同時間下BSA和C12DLPB-BSA熒光強度變化曲線

2.3 離子強度

在實際使用過程中經(jīng)常會有無機鹽類等物質(zhì)存在，因此離子強度是影響C12DLPB-BSA相互作用的重要因素[16,17]，研究了當cC12DLPB為0.2×10-4mol/L，作用時間為15 min時，NaCl濃度對二者相互作用的影響。

由圖3可以看出，從總體的變化趨勢來看，體系熒光強度成上升趨勢。這可能是因為NaCl溶液中的Na+離子能中和蛋白質(zhì)骨架上的負電荷，使得BSA骨架間的靜電斥力降低，BSA鏈緊縮，這樣小分子很難嵌入BSA堿基對中，甚至可能將已經(jīng)嵌插進入堿基對中的小分子重新排擠出來，導致體系熒光增強[18,19]。其中，當加入NaCl溶液的濃度為0.01～0.02 mol/L時，熒光強度比較穩(wěn)定，此時兩個體系中存在物質(zhì)之間的相互作用比較穩(wěn)定。當濃度繼續(xù)增加后，熒光強度增強，因此選取0.02 mol/L為NaCl的最佳濃度。

圖3 NaCl濃度對BSA和C12DLPB-BSA熒光強度的影響

2.4 pH

在應用體系中pH的大小也是影響蛋白質(zhì)與兩親配體間作用的重要因素之一。固定cNaCl為0.02 mol/L，作用時間15 min條件下，考察了不同pH對C12DLPB-BSA和BSA熒光強度的影響，溶液pH用0.01 mol/L的NaOH/HCl調(diào)節(jié)。圖4中a～g表示C12DLPB的濃度分別為0、0.2×10-4mol/L、0.4×10-4mol/L、0.6×10-4mol/L、0.8×10-4mol/L、1.0×10-4mol/L、1.2×10-4mol/L。對于加入不同濃度的C12DLPB的BSA溶液，在pH為2.5～10.5時，體系的熒光強度都有先升高后降低的現(xiàn)象，且在原液（pH＝6.5）系統(tǒng)中有最高的熒光值。當pH為2.5～4.5和6.5～10.5時體系的熒光強度變化較大，在堿性環(huán)境中熒光強度降低比酸性環(huán)境中更強。在pH為4.5～6.5時熒光值比較穩(wěn)定，且在pH＝6.5時（原液），有最高的熒光值，且隨著樣品濃度的增大有相對明顯的猝滅現(xiàn)象，適宜的酸堿環(huán)境為原液系統(tǒng)。

圖4 pH對BSA和C12DLPB-BSA熒光強度的影響

2.5 熒光猝滅機制

小分子引起蛋白質(zhì)熒光猝滅的原因一般有兩種情況：①能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，屬于激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性，為靜態(tài)猝滅。②小分子與蛋白質(zhì)在基態(tài)時發(fā)生配合作用，生成不發(fā)熒光的配合物，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的生理活性，為動態(tài)猝滅[15]。在不同溫度下測得C12DLPB與BSA相互作用的數(shù)據(jù)，運用Stern-Volmer[20]方程對其進行分析（式2）。

F0表示加入C12DLPB前BSA熒光強度；F表示加入C12DLPB后BSA熒光強度；Ksv表示動態(tài)猝滅常數(shù)；τ0表示猝滅體不存在時熒光分子平均壽命(s)；[Q]表示C12DLPB濃度；Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)。以F0/F對[Q]濃度作圖（圖5），288.15K、294.15K、301.15K、308.15K溫度下的數(shù)據(jù)都呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。且由表1可以看出，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)Ksv逐漸升高，此現(xiàn)象為動態(tài)猝滅的特征，但是Kq值大于各類猝滅劑與生物大分子的最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/mol·s，該特征為靜態(tài)猝滅的特征，因此判斷C12DLPB對BSA熒光猝滅的類型為混合熒光猝滅。

表1 不同溫度下C12DLPB對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)

圖5 C12DLPB對BSA作用的Stern-Volmer曲線

C12DLPB與BSA在猝滅過程中的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）可通過修正的Stern-Volmer方程式求得[20]（式3）。

上式中Ka表示結(jié)合常數(shù)，n表示結(jié)合位點數(shù)。通過lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖得到直線斜率和截距能計算出結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)，如圖6和表2所示。當溫度在288.15～294.15K時，Ka隨著溫度升高而增加，說明溫度升高，C12DLPB-BSA形成的復合物穩(wěn)定性增加。當溫度繼續(xù)增加時，Ka隨著溫度升高而減小，說明當溫度在294.15～308.15K時，降低了C12DLPB-BSA復合物的穩(wěn)定性。結(jié)合位點數(shù)n都接近1，證明復合物C12DLPB-BSA的摩爾比為1∶1。溫度越高，n值呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；說明C12DGPB與BSA的結(jié)合程度表明溫度的升高也呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢。

圖6 C12DLPB對BSA作用的修正Stern-Volmer曲線

根據(jù)熱力學參數(shù)間的關(guān)系式可以計算出各種熱力學常數(shù)[21]（式4、式5、式6）。

當溫度變化較小時，反應的焓變（ΔH）能近似認為是常數(shù)。根據(jù)小分子與生物大分子反應的熱力學參數(shù)的變化判斷其作用力類型的規(guī)律[22]，當ΔS和ΔH都＜0時，主要作用力為氫鍵和范德華力；當ΔS和ΔH都＞0時，主要作用力為疏水作用力；當ΔH＜0，ΔS＞0時，主要作用力為靜電作用力[23,24]。從表2看出，ΔS和ΔH都＞0，說明疏水作用力是C12DLPB-BSA之間結(jié)合的主要作用力[25,26]，ΔG＜0，說明二者之間的鍵合反應是一個自發(fā)過程。

表2 不同溫度下C12DLPB對BSA的結(jié)合參數(shù)和熱力學參數(shù)

2.6 三維熒光光譜

三維熒光光譜以發(fā)射波長、激發(fā)波長和熒光強度為坐標的三維空間圖譜，可用強度等高線描述組分的濃度和分布，是考察蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的有效方法[27]。在兩個10 ml容量瓶中分別準確加入1 ml BSA儲備液和1 ml BSA儲備液+7 ml C12DLPB儲備液，相互作用15 min后，采用1.2.2實驗條件，進行三維熒光光譜測定。BSA與C12DLPB-BSA體系的等高線光譜圖如圖7所示，可觀察到明顯的鉛筆狀條紋有一個峰，這個峰反映的是酪氨酸和色氨酸殘基的疏水微環(huán)境[28,29]。從表3的特征參數(shù)可以看出，加入C12DLPB溶液后BSA的熒光峰產(chǎn)生藍移，從341 nm藍移到339 nm，熒光強度由511AU降至453AU，降低了11.5%，說明C12DLPB與BSA的結(jié)合引起了酪氨酸和色氨酸殘基疏水微環(huán)境的變化，從而引起了猝滅現(xiàn)象。

圖7 BSA與C12DLPB-BSA體系的等高線圖譜

表3 C12DLPB對 BSA三維熒光特征峰的影響

3 結(jié)論

C12DLPB能與BSA發(fā)生結(jié)合作用，使BSA的熒光發(fā)生猝滅；二者相互作用的適宜條件為作用時間15 min，pH為原液pH=6.5，NaCl濃度為0.02mol/L；C12DLPB對BSA熒光猝滅過程為混合熒光猝滅；結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n隨著溫度升高先增大后減小，形成復合物穩(wěn)定性隨著溫度的升高先增大后降低；C12DLPB與BSA相互作用力類型主要是疏水作用力，且二者的結(jié)合引起了酪氨酸和色氨酸殘基疏水微環(huán)境的變化。