張強 王再見 李會霞 李彤 雷雪 曲冬梅

1 對象與方法

1.1 對象

選取2020年01月至2021年06月就診于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院的310例APs患者，其中男性為186例，女性為124例，年齡38～74歲，平均年齡62(52，67)歲；其中管狀腺瘤222例，管狀絨毛狀腺瘤66例，絨毛狀腺瘤22例，低級別上皮內瘤變281例，高級別上皮內瘤變29例。另選取腸鏡及病理檢查無異常的健康體檢者75例為正常對照組，其中男性47例，女性28例，年齡31～72歲，平均年齡62(49，67)歲。APs組與正常對照組在年齡和性別方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查(編號：ECGZRSL-ZYDSY2021-13)，同意開展相關研究，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

結直腸腺瘤性息肉的現代醫(yī)學診斷標準參照美國結直腸癌多學會工作組制定的《結腸鏡檢查及息肉切除術后隨訪建議(2020年)》[6]、世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的《消化系統(tǒng)腫瘤分類(2019年)》[7]和中華醫(yī)學會制定的《胃腸道腺瘤和良性上皮性息肉的病理診斷共識(2020年)》[8]。中醫(yī)證型診斷標準參照國家中醫(yī)藥管理局重點?？茖２№椖拷M制訂的《大腸息肉(結腸息肉)中醫(yī)臨床路徑》和中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《中醫(yī)內科常見病診療指南—西醫(yī)疾病部分》[9]和《中藥新藥臨床研究指導原則》[10]中有關胃腸疾病中醫(yī)證型診斷的相關內容，并結合高年資醫(yī)生的臨床經驗，分為大腸濕熱證、濕瘀阻滯證、脾虛濕蘊證和氣滯血瘀證。

1.3 納入標準

(1)年齡≥18歲；(2)腸道準備良好并完成全結腸檢查(結腸鏡到達回盲瓣)；(3)經腸鏡和病理檢查符合上述現代醫(yī)學診斷標準；(4)中醫(yī)四診信息記錄完全，符合上述中醫(yī)證型診斷標準。

1.4 排除標準

(1)腸道準備不充分，影響觀察者；(2)水樣便或不能收集大便者；未完成病理學檢查者；(3)診斷為結直腸惡性腫瘤、炎癥性腸病、缺血性腸炎或非特異性腸炎者；(4)合并有嚴重呼吸、心腦血管疾病或內分泌等疾病者；(5)臨床資料不完整者。

1.5 病例信息采集及臨床資料檢測

制定臨床調查問卷，由經副高或以上級別醫(yī)生指導培訓合格的調查專員收集受檢者的臨床資料，包括：(1)年齡(<60歲、≥60歲)；(2)性別(男、女)；(3)中醫(yī)四診信息(神態(tài)、面色、寒熱、腹部癥狀、大便情況、舌脈等)；(4)腺瘤數量(單發(fā)、多發(fā))；(5)腺瘤大小(<10 mm、≥10 mm)；(6)組織學類型(管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤、絨毛狀腺瘤)；(7)上皮內瘤變程度(低級別、高級別)；(8)糞便SDC2基因甲基化檢測結果。中醫(yī)證型由具有5年工作經驗的主治中醫(yī)師根據患者的癥狀、體征和舌脈進行診斷，然后由另外一位具有相同工作經驗的主治中醫(yī)師進行審核，若兩位中醫(yī)師有不同的辨證意見，則請一位具有10年工作經驗的副主任及以上的中醫(yī)師進行辨證分型，取意見一致者為最終辨證結果。結腸鏡檢查由3年以上操作經驗的主治醫(yī)師或副主任醫(yī)師使用奧林巴斯GIF HQ290腸鏡(奧林巴斯光學，日本，京東)進行操作，術前波士頓腸道準備量表評分≥9分，退鏡時間≥6分鐘。腸鏡下取得標本后，用福爾馬林固定，由2位不知患者內鏡結果的病理醫(yī)師以世界衛(wèi)生組織的診斷標準[7]分別進行病理診斷。其中多發(fā)腺瘤，直徑記錄最大者，病理記錄惡性程度最高者。在腸鏡檢查前使用人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)(廣州市康立明生物科技有限責任公司)的采集裝置收集受檢者5～10 g糞便，標記后于-80℃冰箱內由廣州康立明生物醫(yī)學檢測實驗室在糞便樣本采集36小時內進行糞便SDC2基因甲基化檢測。

1.6 糞便SDC2基因甲基化檢測

糞便SDC2基因甲基化檢測包括DNA的提取、亞硫酸鹽的處理和熒光定量PCR等過程。首先用磁珠捕獲的方法提取人糞便樣本中的SDC2基因和β-肌動蛋白(ACTB)基因，然后用亞硫酸鹽將未發(fā)生甲基化的DNA進行轉化。在同一個反應孔中，采用雙重熒光PCR檢測甲基化的SDC2基因及ACTB基因保守序列，甲基化的SDC2基因通過擴增后由羧基熒光素標記的熒光探針報告擴增信號，ACTB基因擴增后由Texas Red標記的熒光探針報告擴增信號，計算ACTB基因和SDC2基因的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。根據人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒的設定，ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值≤38時判斷樣本為陽性；ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值>38時判定為陰性樣本；ACTB基因Ct值>36或者無Ct值時，判定為樣本不合格。

1.7 研究方法

觀察APs不同年齡分層、性別、腺瘤數量、大小、組織學類型和上皮內瘤變的糞便SDC2基因甲基化特征，比較APs各證型間年齡分層、性別、腺瘤數量、大小、組織學類型、上皮內瘤變和糞便SDC2基因甲基化的差異，觀察APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征，分析APs中醫(yī)證型與組織學類型、上皮內瘤變和糞便SDC2基因甲基化的相關性。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有數據均采用SPSS 24.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。本研究中，年齡為計量資料，經正態(tài)性檢驗不符合正態(tài)分布，以中位數(M)和第25，75百分位數(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U檢驗比較APs和正常對照組兩組間年齡差異。APs各證型的年齡分層、性別、腺瘤數量、腺瘤最大直徑、組織學類型、上皮內瘤變和糞便SDC2基因甲基化等資料為計數資料，以頻數和百分比表示，多組間比較采用Pearsonχ2檢驗或似然比χ2檢驗，兩兩比較采用Pearsonχ2檢驗或連續(xù)校正χ2檢驗。采用Spearman相關系數法觀察中醫(yī)證型與組織學類型、上皮內瘤變和糞便SDC2基因甲基化的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

樓下的小商販里，還有一位賣菜的小伙子，眉清目秀的，透著精干勁兒。一般賣菜的都是老頭或老太太，小伙子在其中格外顯眼。有人打趣說：“你一個大小伙子，干點啥掙得都少不了，干嘛跑這里賣菜？”小伙子哈哈一笑說：“我在這里待的時間不會太長，我賣菜其實就是做點市場調查，為以后搞蔬菜大棚做準備。大伙兒發(fā)現沒有，現在大棚蔬菜很有市場，我打算過一陣回老家，承包幾畝地，種大棚蔬菜。到時候，大爺大娘們到我那里進菜哦，肯定給你們實惠價……”大伙兒都覺得他說的這些沒影兒的事很無趣，沒幾個人搭茬，經常是他一個人雙眼放光地自說自話。

2 結果

2.1 APs各證型臨床病理特征

310例APs患者中，大腸濕熱證78例、濕瘀阻滯證76例、脾虛濕蘊證81例、氣滯血瘀證75例。如表1，APs各證型在年齡、性別及腺瘤數量及大小方面，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 APs各證型年齡、性別及腺瘤數量和最大直徑情況

如表2，APs以管狀腺瘤為主，管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤占比較低。各證型在組織學類型方面，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中各證型在管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤占比方面，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但在管狀絨毛狀腺瘤占比方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。大腸濕熱組(79.49%)管狀腺瘤占比高于氣滯血瘀組(62.67%)，氣滯血瘀組管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤合計占比為37.33%，高于大腸濕熱組(20.51%)和脾虛濕蘊組(22.22%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。濕瘀阻滯組(13.16%)絨毛狀腺瘤占比高于大腸濕熱組(2.56%)和脾虛濕蘊組(2.47%)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 APs各證型病理特征

APs以低級別上皮內瘤變?yōu)橹?，高級別上皮內瘤變占比較低。各證型在上皮內瘤變程度方面，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，濕瘀阻滯組(17.11%)高級別上皮內瘤變占比高于大腸濕熱組(3.85%)和脾虛濕蘊組(6.17%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05)。

2.2 APs糞便SDC2基因甲基化情況

正常對照組和APs組糞便SDC2基因甲基化陽性率分別為14.67%和56.77%，APs組糞便SDC2基因甲基化陽性率明顯高于正常對照組(P<0.001)。

如表3,不同年齡分層、性別、腺瘤數量、大小和組織學類型的糞便SDC2基因甲基化陽性率無明顯差異(P>0.05)。高級別上皮內瘤變(79.31%)糞便SDC2基因甲基化陽性率高于低級別瘤變(54.45%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 APs不同臨床病理類型的糞便SDC2基因甲基化情況

2.3 APs各證型糞便SDC2基因甲基化情況

如表4，APs中醫(yī)各證型SDC2甲基化陽性率大小依次為濕瘀阻滯組(65.79%)>氣滯血瘀組(64.00%)>大腸濕熱組(51.28%)>脾虛濕蘊組(46.91%)。APs證型間糞便SDC2基因甲基化陽性率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩兩比較，濕瘀阻滯組和氣滯血瘀組糞便SDC2基因甲基化陽性率均明顯高于脾虛濕蘊組(P<0.05)，但同大腸濕熱組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 APs各證型糞便SDC2基因甲基化情況

2.4 APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征

如表5，APs糞便SDC2基因甲基化陽性患者中，各證型在組織學類型方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在上皮內瘤變方面，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。濕瘀阻滯組高級別上皮內瘤變占比高于大腸濕熱組和脾虛濕蘊組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征(例)

2.5 APs中醫(yī)證型與病理類型和糞便SDC2基因甲基化的相關性分析

如表6，Spearman相關性分析顯示，大腸濕熱證與組織學類型、上皮內瘤變和糞便SDC2基因甲基化陽性無相關性(P>0.05)。濕瘀阻滯證與絨毛狀腺瘤和高級別上皮內瘤變呈正相關(P<0.05，P<0.01)，與低級別上皮內瘤變呈負相關(P<0.01)。脾虛濕蘊證與糞便SDC2基因甲基化陽性呈負相關(P<0.05)。氣滯血瘀證與管狀腺瘤呈負相關(P<0.05)。

表6 APs中醫(yī)證型與病理類型和糞便SDC2基因甲基化的相關性分析

3 討論

APs屬中醫(yī)學之“腸蕈”“便血”和“泄瀉”等范疇。約70%～80%的結直腸癌由APs通過“正常黏膜—低級別上皮內瘤變—高級別上皮內瘤變—癌”途徑演變而來，APs患者的結直腸癌發(fā)病率和死亡率明顯高于普通人群[11]。由于腺瘤患者的臨床表現錯綜復雜且缺乏特異性，部分結直腸癌患者在確診時已屬晚期。目前，由于缺乏微觀層次的認識和辨證方法，使得APs的辨證分型紛繁復雜且與臨床一致性差，因此，尋找可靠且與證候相關的生物標志物成為APs精準辨證的研究重點。作為表觀遺傳學的經典調控機制，DNA甲基化與中醫(yī)證候的形成均受外界環(huán)境和機體遺傳的共同影響，因此，甲基化的DNA有望成為輔助APs中醫(yī)診斷的生物標志物。本研究將病理類型和基因甲基化特點融入APs的中醫(yī)辨證分型，對中西醫(yī)結合療法在腺瘤的二級預防和結直腸癌的一級預防領域發(fā)揮“未病先防”和“既病防變”的作用具有重要的現實意義。

3.1 APs患者中醫(yī)證型與病理類型具有相關性

中醫(yī)認為APs為本虛標實，虛實夾雜的一種疾患?；颊咭蝻嬍巢还?jié)，情志內傷或起居不慎，致使脾胃功能減弱，脾胃虛則氣機受阻，運化無力，津液聚而成痰濕，氣虛無力推動血行，遂成瘀血，病情遷延日久則濕濁留戀，血行不利，痰、濕、瘀積聚腸道。組織學類型和上皮內瘤變程度不同，腺瘤的病位深淺和病性虛實亦有差異。本研究中，各證型的組織學類型分布存在差異，濕瘀阻滯證和氣滯血瘀證中絨毛狀腺瘤占比較高，原因可能是，同管狀腺瘤相比，絨毛狀腺瘤表面黏膜多為分葉狀且易出血。本研究發(fā)現，濕瘀阻滯組中高級別上皮內瘤變占比為17.11%，明顯高于脾虛濕盛證和大腸濕熱證。提示，濕瘀阻滯證更易伴有高級別上皮內瘤變。原因可能是，上皮內瘤變早期多為脾虛濕盛證或大腸濕熱證，患者正氣虧虛不甚，尚能鼓邪外出，但隨著病情遷延和瘤體增長，臟腑功能衰退，衛(wèi)外抗邪功能減弱，正氣無以鼓邪外出，致邪氣積聚日久，氣滯血凝，滋生痰濁，變生積聚，瘤體生長及癌變?yōu)闈耩瞿Y和癌毒內生的結果。

3.2 甲基化的SDC2基因是APs的重要生物標志物

DNA甲基化是指以S—腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基化轉移酶的作用下，DNA序列中的胞嘧啶堿基共價鍵結合一個甲基基團。越來越多的研究表明，腸黏膜細胞DNA序列中CpG 島的 CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化貫穿于“腺瘤—癌序列”的整個過程[5, 12-13]。SDC2基因是轉化生長因子B通路的一個關鍵基因，參與細胞增殖與遷移和血管生成等多種生物過程，可通過上皮間質轉化和絲裂原活化蛋白激酶途徑促進腺瘤的生長、癌變及轉移。本研究發(fā)現，APs患者糞便SDC2基因甲基化陽性率明顯高于正常對照組，提示結直腸腺瘤與SDC2甲基化相關。馬曉陽等[14]在大腸癌患者、大腸腺瘤患者和正常人群糞便中發(fā)現SDC2甲基化的陽性率分別為78.1%、57.1%和2.5%。因此，SDC2可作為結直腸腫瘤的一種新的表觀遺傳標志物。

目前普遍認為，上皮內瘤變程度的加重是APs向癌癥轉化的重要步驟[15-16]。在本研究中，在高級別上皮內瘤變的SDC2甲基化陽性率為79.31%，明顯高于低級別上皮內瘤變(P<0.01)。既往的研究表明，SDC2甲基化在結直腸癌中的陽性率為90.90%，在高級別上皮內瘤變中的陽性率達到了80.00%，但在正常人群中陽性率極低[17]。這提示，SDC2甲基化程度在正常腸黏膜由低級別上皮內瘤變至高級別上皮內瘤變這一過程中呈遞增趨勢。但是，在本研究中，管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤糞便SDC2基因甲基化陽性率與管狀腺瘤相比，差異并無統(tǒng)計學意義。提示腺瘤患者糞便SDC2基因甲基化可能與組織學類型無關。原因可能是，糞便SDC2基因甲基化是結直腸腫瘤發(fā)生的早期事件，其發(fā)生早于組織學改變，這與馬曉陽等[14]和王小軍等[17]的研究結果基本一致。

3.3 APs患者中醫(yī)證型與糞便SDC2基因甲基化具有相關性

中醫(yī)的“證候”反映了機體的病變部位和病邪性質，不僅受年齡、地域環(huán)境及生活習慣的影響，近年來蛋白組學、代謝組學、轉錄組學以及基因組學研究表明，基因可以影響癥候的表達。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子學本質是細胞內遺傳調控和表觀遺傳調控的紊亂，“腺瘤—癌序列”是一個多基因參與的、多階段、多步驟改變并積累的復雜過程。基因可通過對蛋白質的表達與調控對癥候表現產生不同的影響，進而影響中醫(yī)辨證分型。因此研究基因微觀分子水平的APs中醫(yī)辨證分型特點，可以使我們了解中醫(yī)證型反映疾病的病程階段、病情輕重、預后等，為辨證分型提供客觀依據。

本研究中，糞便SDC2基因甲基化陽性率在脾虛濕蘊組、大腸濕熱組、氣滯血瘀組和濕瘀阻滯組中分別為46.91%、51.28%、64.00%和65.79%，呈遞增趨勢，濕瘀阻滯組和氣滯血瘀組糞便SDC2甲基化陽性率明顯高于脾虛濕蘊證。提示糞便SDC2基因甲基化與“瘀血”有關。并且，在APs糞便SDC2基因甲基化陽性患者中，濕瘀阻滯組高級別上皮內瘤變占比較高，原因可能是，患者長期飲食不節(jié)，情緒不暢，隨著病程進展，患者器官機能衰退，加之伴有多種慢性疾病，機體免疫調節(jié)紊亂，脾虛日久則出現肝脾腎俱虛，脾腎陽氣不足，無力運化，濕濁更甚，濕濁與瘀血內結，釀生癌毒。

綜上所述，APs中醫(yī)證型與臨床病理類型和糞便SDC2基因甲基化存在相關性，可為APs的中醫(yī)微觀辨證提供參考依據。但本研究為單中心研究，且絨毛狀腺瘤和高級別上皮內瘤變數量偏少，樣本的選擇具有局限性，且中醫(yī)證型易受地理環(huán)境和生活方式等因素影響，因此，下一步可擴大樣本量進行多中心研究。