姜 偉，郭明佳，吳樹(shù)康，金彩虹

（龍口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東龍口 265701）

關(guān)鍵字：多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；抗原蛋白；克??；原核表達(dá)

豬出血性敗血癥，又稱(chēng)“豬肺疫”，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一種以敗血癥和高度呼吸困難等為主要特征的烈性傳染病。該病無(wú)年齡和季節(jié)特異性，所有年齡段的豬均易發(fā)病，一年四季均可發(fā)生，且常見(jiàn)于氣溫驟變等外界環(huán)境發(fā)生突變時(shí)，每年對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Pm 是一種條件致病菌，在全球范圍內(nèi)廣泛分布，常寄生于宿主咽喉等部位，可以感染包括家畜、家禽、野生動(dòng)物及人類(lèi)在內(nèi)的多種宿主[1-3]。根據(jù)特異性莢膜（K）差異，Pm 可分為A、B、D、E 和F 5 種血清型，其中引起豬巴氏桿菌病的主要為B 莢膜型菌株。

Pm 含有外膜蛋白（Omps）、菌毒素（Toxin）、鐵代謝相關(guān)蛋白（IROMPs）、裂解酶（AspA）和三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAAs）等多種免疫原性蛋白。研究[4-6]表明，體外表達(dá)這些蛋白制備的亞單位疫苗均可給宿主提供部分免疫保護(hù)力。目前關(guān)于豬源Pm Omps 相關(guān)研究較多，而關(guān)于AspA 和TAAs 免疫原性情況則缺少相關(guān)報(bào)道，且對(duì)主要抗原蛋白免疫原性的系統(tǒng)比較也仍需研究。

本試驗(yàn)成功分離了一株豬源Pm，并以其基因組為模板成功克隆了5 個(gè)主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），隨后利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了5 個(gè)重組抗原蛋白，為相關(guān)蛋白免疫原性研究及系統(tǒng)比較奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯（HB0108）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（HB4114）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（HB0177）、細(xì)菌生化鑒定管，購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；細(xì)菌全基因組DNA 提取試劑盒（D1800）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（D1100），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（9057）、pMD18-T（6011）、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（9126），購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；IPTG（GF101）、EasyTaqDNA Polymerase（AP111），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit（C115-01），購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody（CW0286）、Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated（CW0102）、eECL Western blot Kit（CW0049），購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.2 病原分離與鑒定

1.2.1 病原分離與純化培養(yǎng) 2021 年3 月，龍口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心收到該市某養(yǎng)豬場(chǎng)送檢的發(fā)病死亡病料，根據(jù)其臨床癥狀初步判斷為疑似巴氏桿菌感染。采集發(fā)病死亡仔豬的肝臟和脾臟進(jìn)行觸片檢測(cè)，經(jīng)革蘭氏和瑞氏染色并鏡檢；將采集的肝臟和脾臟等組織無(wú)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，無(wú)菌挑取培養(yǎng)物采用“四線三區(qū)”法接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行分離純化。

1.2.2 生化鑒定 挑取可疑菌菇接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)無(wú)菌接種于細(xì)菌生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，最后將結(jié)果與伯杰氏手冊(cè)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 PCR 鑒定 依據(jù)Pm 特異性基因Kmt序列，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性鑒定引物（P1/P2，表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。以分離株基因組為模板，采用P1、P2 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳回收后連接pMD-18T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 后挑取單個(gè)菌落送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì)。

表1 PCR 鑒定所用引物信息

1.2.4Kmt基因遺傳進(jìn)化分析 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)下載國(guó)內(nèi)外已分離測(cè)序的PmKmt基因序列，使用DNAstar 及Mega 5.0 軟件[7]對(duì)分離株及參考菌株Kmt基因序列進(jìn)行同源性分析，并采用maxmium likelihood 方法構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。參考序列詳情見(jiàn)表2。

表2 參考菌株Kmt 基因序列信息

1.3 主要抗原蛋白基因克隆與原核表達(dá)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 中菌株P(guān)m 8-6 全基因組序列（登錄號(hào)CP040918），使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)Pm 5 個(gè)主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA）的上下游引物，并在引物兩端加入針對(duì)表達(dá)載體的特異性同源臂，引物序列具體信息見(jiàn)表3。

表3 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物信息

1.3.2 pCold-I 重組質(zhì)粒構(gòu)建 利用1.3.1 中設(shè)計(jì)的各基因擴(kuò)增引物，以分離株全基因組為模板，PCR 擴(kuò)增獲得各基因目的產(chǎn)物；同時(shí)使用BamHⅠ和KpnⅠ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)原核表達(dá)載體pCold-I 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將PCR 產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的大小位置條帶；使用ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit 同源重組試劑盒連接線性化的pCold-I 質(zhì)粒與帶有同源臂的基因片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h；挑取單個(gè)菌落并鑒定，將陽(yáng)性樣品送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.3 主要抗原蛋白基因原核表達(dá)與鑒定 使用質(zhì)粒提取試劑盒，提取測(cè)序結(jié)果正確樣品的重組質(zhì)粒，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h；挑取單個(gè)菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，按體積比1:1 000 比例取10 μL 菌液接種于10 mL 含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD450nm為0.4～0.5，加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 16 ℃低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)物4 000 r/min離心15 min，棄上清后加入1 mL PBS 重懸，取40 μL 重懸后樣品加入10 μL 蛋白上樣緩沖液，變性煮樣后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，以His-Tag 單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)樣品進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 病原分離及鑒定

2.1.1 分離菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察 采集發(fā)病死亡仔豬臟器進(jìn)行觸片染色后鏡檢。革蘭氏染色可見(jiàn)大量呈革蘭氏陰性的大小不一的球桿菌（圖1）；瑞氏染色結(jié)果顯示，兩極呈明顯濃染，符合巴氏桿菌的染色特性。將無(wú)菌采集的臟器接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，可見(jiàn)該分離菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)貧瘠而在胰蛋白胨大豆肉湯中生長(zhǎng)旺盛。在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中，分離菌形成大小一致，帶有淡藍(lán)色光澤的濕潤(rùn)、圓形露珠樣小菌落，將分離純化所得菌株命名為L(zhǎng)K01。

2.1.2 分離菌生化鑒定 根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)各生化結(jié)果進(jìn)行判定，并與伯杰氏手冊(cè)進(jìn)行比對(duì)。生化結(jié)果具體見(jiàn)表4，初步判定本次分離的病原菌為豬源Pm。

表4 分離菌株LK01 生化特性鑒定結(jié)果

2.1.3 PCR 鑒定 Pm 特異性基因Kmt的PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，本次分離菌株可擴(kuò)增得到大小約347 bp 的特異性片段，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后連接載體送至生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行在線Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分離菌株與其他PmKmt基因核苷酸同源性最高可達(dá)100%，因此確定本次分離菌株LK01 為豬源Pm。

2.1.4Kmt基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析 從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已公布的14 個(gè)國(guó)內(nèi)外Pm代表株序列，使用DNA star 和Mega 5.0 軟件對(duì)LK01 株及其他Pm 毒株Kmt基因進(jìn)行核苷酸同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，所有毒株共被分為兩個(gè)大分支，且這兩個(gè)分支的分類(lèi)與分離菌株分離的時(shí)間、地區(qū)、宿主動(dòng)物無(wú)明顯相關(guān)性。本次分離菌株LK01 與CQ2、EGY45 和P2-09-12-15Lb 株的親緣關(guān)系最近，其中CQ2 為國(guó)內(nèi)牛源分離株。

2.2 主要抗原蛋白基因克隆與原核表達(dá)

2.2.1 主要抗原蛋白基因克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建以分離菌株LK01 全基因組DNA 為模板，對(duì)OmpA、OmpH、AspA、pIpE和TAA5 個(gè)主要抗原蛋白基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，分別在819、582、1 419、1 017 和1 236 bp 處有與預(yù)期大小相符的特異性擴(kuò)增條帶。將PCR 產(chǎn)物回收后，采用同源重組方式與雙酶切回收后的pCold-I 原核表達(dá)載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后挑取單個(gè)菌落送至生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在線Blast 比對(duì)顯示，擴(kuò)增片段均為Pm 主要抗原蛋白基因。

2.2.2 重組抗原蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

各重組蛋白Western blot 檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，分別在30.0、21.5、52.0、37.5 和45.5 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶，而誘導(dǎo)的空載對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶，表明各個(gè)重組蛋白均成功表達(dá)。

3 討論

Pm 是巴氏桿菌屬中一種重要的條件性致病菌，可以感染馬、牛、羊、豬、雞、鴨等多種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，常引起動(dòng)物出現(xiàn)敗血癥等并導(dǎo)致死亡，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從發(fā)病死亡仔豬臟器中分離出一株病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特性鑒定、生化鑒定及Kmt基因PCR 檢測(cè)等綜合分析，確定該分離株為一株豬源Pm。

近年來(lái)抗生素濫用導(dǎo)致多重耐藥菌產(chǎn)生，而臨床上常用豬巴氏桿菌病疫苗主要是采用莢膜抗原B 型的豬源Pm 經(jīng)甲醛滅活制備，存在滅活不完全的潛在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)滅活苗對(duì)同抗原型的保護(hù)力較好而對(duì)A 型和D 型Pm 的交叉保護(hù)力還有待提高。因此篩選出具有良好交叉免疫原性的抗原蛋白，研發(fā)單價(jià)或多價(jià)重組亞單位疫苗顯得尤為重要[7-8]。OmpH和OmpA蛋白作為Pm外膜蛋白的重要組分，有研究[9-11]表明，單獨(dú)或融合表達(dá)兩個(gè)蛋白均可給宿主動(dòng)物提供一定保護(hù)力，但保護(hù)力差于弱毒苗或滅活苗。脂蛋白pIpE 是另一類(lèi)大量存在于Pm 外膜上的重要蛋白，研究[4，12]表明，體外重組表達(dá)的pIpE 蛋白不僅具有良好保護(hù)力，且對(duì)不同亞型Pm 具有一定程度的交叉保護(hù)性。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAA 是在革蘭氏陰性菌外膜上廣泛分布的一類(lèi)重要蛋白，影響病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的吸附、侵襲以及生物膜形成[13]；天冬氨酸裂解酶AspA 蛋白是巴氏桿菌生命活動(dòng)過(guò)程中一種重要分泌蛋白，該蛋白除了發(fā)揮其正常生物學(xué)功能以外也能給宿主動(dòng)物提供較好的免疫保護(hù)力。這兩類(lèi)蛋白均可以作為研發(fā)新型亞單位疫苗的候選靶標(biāo)[14-16]，但目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少，且關(guān)于豬源Pm 相關(guān)蛋白的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)成功分離了一株豬源Pm，并以其基因組為模板成功克隆了5 個(gè)主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），使用原核表達(dá)載體pCold-I 構(gòu)建了相關(guān)基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5 個(gè)重組蛋白均成功表達(dá)。本試驗(yàn)首次克隆并表達(dá)了豬源PmAspA和TAA基因，為相關(guān)蛋白免疫原性研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于對(duì)豬源Pm 常見(jiàn)抗原蛋白開(kāi)展系統(tǒng)性比較，從而篩選出抗原性較強(qiáng)且能提供良好交叉保護(hù)力的抗原蛋白。